如何利用meta分析发顶刊

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小伙伴们大家好，今天想跟大家分享的是一篇于今年2月份发表在Cell（IF：41.582）上的一篇文章。感到惊喜的是，该文章是一篇利用公开数据进行的meta分析。让我们来看看这篇文章的主要内容，看看别人为什么可以发到那么高，而我们又能从中借鉴什么呢？

Meta-analysis of tumor and T cell-intrinsic mechanisms of sensitization to checkpoint inhibition
肿瘤和T细胞对免疫检查点抑制敏感的内在机制的meta分析

一、免疫检查点抑制剂（CPI）应答标志物效能的系统评估
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作者从12篇研究中收集了1000多个接受免疫治疗的样本，获取响应的临床响应信息以及基因组或转录组数据，并进行了一套标准的数据处理流程（图1）。同时作者查阅了723篇相关文献，收集了55个CPI的应答标志物。有了这些准备后，作者分别在每一套数据集中评估这些应答标志物的预测效能，然后通过meta分析将效应量整合起来（图2A）。由结果可以看出，在所有12项研究中，预测效应最强的生物标志物是克隆性的TMB，接着是总TMB，而亚克隆TMB于CPI反应没有显著的相关性。此外许多与抗原相关的标志物（sources of antigen）均与CPI应答相关。免疫浸润类的标志物（immune infiltration）预测效能较优，其中 CXCL9表达是效应最强的预测因子。值得注意的是，尽管一些标志物效应较高，但缺乏统计学意义上的关联，这并不排除这些过程在决定CPI反应中具有潜在生物学作用（数据量较小）。此外，对于较罕见的突变事件，该分析力度不足，如B2M突变或缺失仅在1.4%的病例中发现，这意味着可能需要更大的样本量来确认这些事件在影响CPI反应中的作用。

接下来，作者按癌症或药物类型来分析这些数据集，评估了四组数据：黑色素瘤抗PD-1/L1、黑色素瘤抗CTLA-4、尿路上皮癌抗PD-1/L1和非小细胞肺癌抗PD-1/L1。除HLA B44和种系HLA-I进化差异外，个体亚组中显著的生物标志物多数与泛癌meta分析中显著的生物标志物相同（图2B）。同时药物组织学差异反映了预期模式，如CD274（PD-L1）表达在黑色素瘤抗PD-1/L1队列中显著，但在抗CTLA-4队列中不显著。

最后作者评估了生物标志物之间的相关性水平，观察到每个类别中指标之间的高水平相关性（图2C）。突变指标如TMB和克隆TMB彼此之间具有很强的相关性，同样CD8A和CXCL9等免疫浸润标志物之间也存在相关性。然而，不同的生物标志物类别之间的相关性通常很低，如抗原生物标志物的来源在很大程度上与免疫浸润标志物不相关，这表明将多个标志物结合在一起具有潜在的非冗余效应。作者量化了各种CPI响应标志物对应答的解释程度，结果表明所有标志物的解释程度在0.6左右，即还有40%的决定ICB应答的因素没有被发现（图2D）。

图1. Meta分析的数据处理流程

图2. CPI响应相关的标志物评估

二、CPI应答的多变量预测模型

作者评估完一些标志物后，观察到了CPI应答标志物的复杂性，进而他们探讨了是否可以将这些标志物组合，形成一个整合标志物来提高预测CPI应答的效能。作者使用上述meta分析中11个显著与CPI应答相关的预测因子，基于XGBoost方法构建多变量的预测模型来预测CPI治疗的应答。由于不同的癌症类型可能有些差别，所以作者针对每一个癌症类型都构建了预测模型（图3A）。然而，这些模型也显示出了很强的相似性，如克隆性TMB和CXCL9在多个模型中的贡献均排在前两位（图3A）。因此，作者根据以上列出的11个生物标志物集合（图3B），使用所有的1008个样本训练出最终的泛癌模型，特征重要度评分如图3C。接着作者对模型在3个独立的验证集进行评估，发现多变量的预测模型的预测效能在3个独立的数据集中均优于TMB（图3D）。

图3. CPI应答的多变量预测模型

由于目前的生物标记物仅提供了CPI反应相关的部分解释，作者接下来进行了发现分析，在队列中寻找额外的反应预测因子。鉴于TMB的重要性，作者进而评估突变过程与治疗应答的关系。其中对于每个突变过程，作者测试了该过程的贡献度与CPI响应之间的关联，其中5个与CPI的应答相关（图4A）。

接下来，作者试图识别这些突变过程的特性，这些特性可能导致形成更多的免疫抗原表位。有趣的是，作者发现signature4（烟草暴露相关）和signature 7（紫外线照射相关）和二核苷酸变异（DNV）数目之间具有很强的相关性（图4B）。二核苷酸变异可能会使氨基酸产生更大的变化，同样作者发现对于SNV突变来说，只观察到150种氨基酸变化模式，而DNV则产生250种不同的氨基酸变化模式（图4C）。同时DNV产生的氨基酸改变更大，具有较高的Grantham距离（衡量氨基酸相似性的测度）和疏水性差异（图4D），而高的疏水性评分倾向于为T细胞反应性表位（图4E）。在这里作者做的细节非常到位，详细剖析了突变过程贡献较好CPI应答的原因。

图4.与CPI响应相关的突变过程

三、拷贝数与CPI相应之间的关联

作者还在样本集中进行了体细胞拷贝数分析，以寻找与CPI响应相关的拷贝异常位点。虽然没有发现SCNV的总负荷与应答相关（图2A），但特定位点的改变可能会导致对治疗的耐药性或敏感性（图5AB）。差异最显著的区段是9q34，应答者的丢失频率为44.4%，而无应答者的丢失频率为30.5%（图5B）。因此，9q34缺失与CPI治疗的敏感性相关，对该位点进行精细定位发现频率差在9q34.3处出现一个尖峰，与TRAF2基因直接重叠（图5C）。同时在整个泛癌、尿路上皮癌、黑色素瘤和其他肿瘤类型队列中，TRAF2缺失在应答者中均显著增加（图5D）。此外作者注意到大多数9q34缺失是单等位基因丢失事件，进一步研究表明 TRAF2很可能具有单倍体剂量不足的效应（图5E）。

图5. CPI应答者和非应答者的拷贝数扩增和缺失谱

接下来作者考虑了癌基因和抑癌基因的区域扩增和纯合子缺失事件是否与CPI反应相关。结果发现CCND1扩增肿瘤的CPI应答率显著降低（图6A），尿路上皮癌中CCND1扩增肿瘤的数量最高（图6B），同时观察到在尿路上皮癌种无应答者的CCND1表达水平显著高于应答者（图6C）。为了验证CCND1扩增在与CPI应答的关联，作者在接受CPI治疗的尿路上皮癌队列中观察到CCND1扩增与总体生存较差显著相关（图6D）。作为阴性对照，在没有使用CPI治疗的尿路上皮癌患者两组的总体生存期没有差异（图6E）。这种现象在泛癌队列中仍然存在（图6F和G）。这些数据表明CCND1扩增与CPI应答存在相关性，而与常规预后无关。

图6. CCND1扩增与CPI应答相关

四、结合单细胞数据的分析

克隆突变负荷在先前评估中作为较优的生物标志物，这表明以克隆性新抗原为靶点的T细胞应答在免疫治疗期间具有关键作用。为了检验是否克隆性新抗原激活的T细胞所表达的基因能进一步解释克隆性新抗原与CPI响应的关联，作者对一名未经治疗的非小细胞癌患者的CD8 TILs进行了单细胞测序，并根据克隆性新抗原（MTFR2）是否为阳性进行了分类。来自同一区域的阳性细胞相对于阴性细胞有846个基因显著上调（图7A），涉及的功能包括抗原呈递、T细胞激活转运和T细胞功能障碍等。这些基因在CPI队列中，应答者的表达显著高于无应答者（图7B），尤其是CXCL13和CCR5（图7C）。

图7.克隆性新抗原为靶点的T细胞应答在免疫治疗过程中的作用

本篇文章的内容就是这些，让我们来简要总结下该文章的思路。首先作者整合了大量的CPI数据集，系统的评估了现有的CPI应答相关的标志物，然后作者基于此构建一个多变量的预测模型，最后作者还对CPI响应相关的突变过程、拷贝数和克隆性新抗原进行了深入分析。本篇研究不愧是发在顶级期刊上的文章，系统且标准化的数据收集处理流程为后续的分析奠定了扎实的基础，此外作者对各个细节的把控相当到位，这对主要结果的证明起到了画龙点睛的作用。这也为我们的研究扩展思路提供了帮助，在我们研究突变过程时会不会想到二核苷酸突变呢？在研究拷贝数时会不会联想到单倍体剂量不足呢？同时本文的思路是否能扩展为评估不同signature的预后呢？相信本文会给大家带来大量的收获，最后祝大家科研顺利！