概述

• 生物体内的蛋白质以mRNA为模板而合成。在这一过程中，mRNA上来自DNA基因编码的核苷酸序列信息转换为蛋白质中的氨基酸序列，故称为翻译（translation）。
• 翻译是指在多种因子辅助下，由tRNA携带并转运相应氨基酸，识别mRNA上的三联体密码子，在核糖体上合成具有特定序列多肽链的过程。

蛋白质生物合成体系

体系概述

• 基本原料：20种编码氨基酸
• 模板：mRNA
• 适配器：tRNA
• 装配机：核蛋白体
• 主要酶和蛋白质因子：氨基酰-tRNA合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释放因子等
• 能源物质：ATP、GTP
• 无机离子：Mg2+、 K+

mRNA是蛋白质合成的信息模版

mRNA的基本结构

• 从mRNA 5’-端起始密码子AUG到3’-端终止密码子之间的核苷酸序列，称为开放阅读框架(open reading frame, ORF)。
• 原核生物是多顺反子，真核生物为单顺反子

顺反子

• 顺反子（cistron）：即结构基因，为决定一条多肽链合成的功能单位。1955年，美国分子生物学家本泽（Benzer）通过对噬菌体T4的rII区基因的深入研究，揭示了基因内部的精细结构。提出了基因的顺反子概念。 他在一个基因内部，可以发生若干不同位点的突变，倘若在一个基因内部发生两个以上位点的突变，其顺式和反式结构的表型效应是不同的。
• 在原核细胞中，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开，这种mRNA叫做多顺反子mRNA。

遗传密码

密码子

• 在mRNA的开放阅读框架区，以每3个相邻的核苷酸为一组，代表一种氨基酸(或其他信息)，这种三联体形式的核苷酸序列称为密码子。

  起始密码子和终止密码子

• 起始密码子(initiation codon)：AUG （甲硫氨酸）

• 终止密码子(termination codon) ：UAA、UAG、UGA

  遗传密码表

  

  AUG(Met) UGG(Trp)是Met Trp氨基酸的唯一编码的密码子

遗传密码的特点

方向性(directional)

• 翻译时遗传密码的阅读方向是5’→3’，即读码从mRNA的起始密码子AUG开始，按5’→3’的方向逐一阅读，直至终止密码子。

连续性(non-punctuated, commaless)

• 编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码子及密码子的各碱基之间既无间隔也无交叉。

• 由于密码子的连续性，在开放阅读框中发生插入或缺失1个或2个碱基的基因突变，都会引起mRNA阅读框架发生移动，称为移码（frame shift），使后续的氨基酸序列大部分被改变，其编码的蛋白质彻底丧失功能，称之为移码突变(frameshift mutation) 。

简并性(degeneracy)

• 一种氨基酸可具有2个或2个以上的密码子为其编码。这一特性称为遗传密码的简并性。
• 除色氨酸和甲硫氨酸仅有1个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。为同一种氨基酸编码的各密码子称为简并性密码子，也称同义密码子 。

摆动性(wobble)

• 反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律，这种现象称为摆动配对(wobble base pairing)。 | tRNA反密码子
  第1位碱基 | I | U | G | A | C | | —- | —- | —- | —- | —- | —- | | mRNA密码子
  第3位碱基 | U, C, A | A, G | U, C | U | G |

通用性(universal)

• 从简单的病毒到高等的人类，几乎使用同一套遗传密码，因此，遗传密码表中的这套“通用密码”基本上适用于生物界的所有物种，具有通用性。 密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。

氨基酰-tRNA通过其反密码子与mRNA中对应的密码子互补结合

tRNA的作用

• 运载氨基酸：氨基酸各由其特异的tRNA携带，一种氨基酸可有几种对应的tRNA，氨基酸结合在tRNA 3ˊ-CCA的位置，结合需要ATP供能；
• 充当“适配器”：每种tRNA的反密码子决定了所携带的氨基酸能准确地在mRNA上对号入座。

  tRNA的构象

  

  核糖体是肽链 “装配厂”

  核糖体的组成

  核糖体又称核蛋白体，是由rRNA和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，是蛋白质生物合成的场所。

  不同核糖蛋白体的组成

  | | 原核生物 | | | 真核生物 | | | | —- | :—-: | :—-: | —- | —- | —- | —- | | | 核蛋白体 | 小亚基 | 大亚基 | 核蛋白体 | 小亚基 | 大亚基 | | S值 | 70S | 30S | 50S | 80S | 40S | 60S | | rRNA | | 16S-rRNA | 23S-rRNA
  5S-rRNA | | 18S-rRNA | 28S-rRNA
  5.8S-rRNA
  5S-rRNA | | 蛋白质 | | rpS 21种 | rpL 36种 | | rpS 33种 | rpL 49种 |

核糖体在翻译中的功能部位

肽链生物合成需要酶类和蛋白质因子

过程中重要的酶

• 氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl tRNA synthetase)，催化氨基酸的活化；
• 转肽酶(peptidase)，催化核蛋白体P位上的肽酰基转移至A位氨基酰-tRNA的氨基上，使酰基与氨基结合形成肽键;并受释放因子的作用后发生变构，表现出酯酶的水解活性，使P位上的肽链与tRNA分离；
• 转位酶(translocase)，催化核蛋白体向mRNA3’-端移动一个密码子的距离，使下一个密码子定位于A位。

  几种重要的因子

  起始因子（initiation factor，IF）
  延长因子（elongation factor，EF）
  释放因子（release factor，RF）

参与原核生物翻译的各种蛋白质因子及其生物学功能

参与真核生物翻译的各种蛋白质因子及其生物学功能

氨基酸与tRNA的连接

氨基酰-tRNA合成酶识别特定氨基酸和tRNA

反应过程

氨基酰tRNA合成酶都具有高度专一性，既能识别特异的氨基酸，又能辨认应该结合该种氨基酸的tRNA分子。

第一步反应

第二步反应

反应特性

• 氨基酰tRNA合成酶还有校对活性（proofreading activity），能将错误结合的氨基酸水解释放， 即将任何错误的氨基酰-AMP-E复合物或氨基酰-tRNA的酯键水解，再换上与密码子相对应的氨基酸，改正反应的任一步骤中出现的错配，保证氨基酸和tRNA结合反应的误差小于10-4。

• 活化一分子tRNA相当于消耗2分子ATP

  氨基酰-tRNA的表示方法

• 各种氨基酸和对应的tRNA结合后形成的氨基酰-tRNA表示为： 氨基酸的三字母缩写-tRNA氨基酸的三字母缩写

• 例如

肽链合成的起始需要特殊的起始氨基酰-tRNA

真核生物

原核生物

• fMet-tRNAfMet的生成是一碳化合物转移和利用的过程之一
• 反应由转甲酰基酶催化，甲酰基从N10-甲酰四氢叶酸转移到甲硫氨酸的α-氨基上。

肽链的生物合成过程

• 翻译过程从阅读框架的5´-AUG开始，按mRNA模板三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。
• 整个翻译过程可分为 ：
  • 氨基酸活化与搬运(activation & transport)
  • 翻译的起始(initiation)
  • 翻译的延长(elongation)
  • 翻译的终止(termination)

氨基酸的活化

肽链合成的起始

• 指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物 (translational initiation complex)。

  原核生物翻译起始复合物的形成

• 核蛋白体大小亚基分离；

• mRNA在小亚基定位结合；
• 起始氨基酰-tRNA的结合；

• 核蛋白体大亚基结合。

  核蛋白体大小亚基分离

  

  mRNA在小亚基定位结合

  

  SD序列

  

• 是mRNA起始部位的剪辑序列，也为mRNA与核糖体的结合位点

• 与核蛋白体的小亚基16S-rRNA结合

  起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )结合到小亚基

  

• 需要IF-2因子辅助

  核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成

  

• 需要消耗能量，1 GTP->GDP

  肽链合成的延长

• 指根据mRNA密码序列的指导，次序添加氨基酸从N端向C端延伸肽链，直到合成终止的过程。

• 肽链延长在核蛋白体上连续性循环式进行，又称为核蛋白体循环(ribosomal cycle)，每次循环增加一个氨基酸

• 包括以下三步：

  • 进位(entrance)
  • 成肽(peptide bond formation)
  • 转位(translocation)

    原核生物翻译过程中核蛋白体的结构模式

• 延伸过程所需蛋白因子称为延长因子(elongation factor, EF)

• 原核生物：
  • EF-T (EF-Tu, EF-Ts)
  • EF-G
• 肽链合成的延长因子 | 原核延长因子 | 生物功能 | 对应真核延长因子 | | :—-: | :—-: | :—-: | | EF-Tu | 促进氨基酰-tRNA进入A位，结合分解GTP | EF-1-α | | EF-Ts | 调节亚基 | EF-1-βγ | | EFG | 有转位酶活性，促进mRNA-肽酰-tRNA由A位前移到P位，促进卸载tRNA释放 | EF-2 |

进位

• 又称注册(registration)
• 指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA（GTP）进入核蛋白体A位。
• 消耗能量(1 GTP)

• 延长因子EF-T催化进位（原核生物）

  成肽

• 是由转肽酶(transpeptidase)催化的肽键形成过程。

• 成肽不消耗能量，肽酰基tRNA本身为活化形式

  转位

• 需要消耗1 GTP

  合成100个氨基酸的肽链，共需要：氨基酰-tRNA活化200ATP，起始复合物合成1ATP，进位99ATP，成肽0ATP，转位100ATP(含1ATP用于终止阶段)

肽链合成的终止

• 当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。
• 终止相关的蛋白因子称为释放因子(release factor, RF)
  • 原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3
  • 真核生物释放因子：eRF
• 释放因子的功能
  • 识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA。
  • 诱导转肽酶改变为酯酶活性，催化肽酰基转移到水分子-OH上，使肽链从核蛋白体上释放。

多聚核糖体(polysome)

• 1条mRNA模板链都可附着10～100个核蛋白体，这些核糖体依次结合起始密码子并沿5’→3’方向读码移动，同时进行肽链合成，这种mRNA与多个核糖体形成的聚合物称为多聚核糖体(polysome) 。
• 多聚核糖体的形成可以使蛋白质生物合成以高速度、高效率进行

真核生物的翻译与细菌翻译系统的对比

• 核糖体的沉降系数为80S，比原核系统大；
• mRNA模板的结构差别很大，通常是单顺反子，有帽子和尾巴，但没有SD序列；
• 转录和翻译在时空上分离，分别发生在细胞核和细胞质，两者不存在偶联关系；
• 起始tRNA不进行甲酰化，也不能进行甲酰化；
• 起始阶段不仅消耗GTP，还消耗ATP；
• 起始因子的种类和结构更为复杂；
• 肽链延伸的速度低于细菌，大概是每秒钟参入2个氨基酸；

• 对抑制剂的敏感性不同。

  过度翻译

• 发生在非真核生物中

• 水稻黄斑病毒(rice yellow mottle virus，RYMV)的拟病毒，由220碱基的闭合环状RNA构成，按道理只能编码73aa的蛋白，但实际上编码的蛋白达16kDa.
• 原因：第一轮翻译，剩下一个G，与起始密码子AU构成一个密码子（GAU）。进行第二轮翻译，第二轮结束时，产生UGA。

肽链生物合成后的加工和靶向运输

• 新生多肽链不具备蛋白质的生物学活性，必须经过复杂的加工过程才能转变为具有天然构象的功能蛋白质，这一加工过程称为翻译后加工。

• 蛋白质合成后在细胞内被定向输送到其发挥作用部位的过程称为蛋白质的靶向输送（protein targeting）或蛋白质分选（protein sorting）。

  翻译后正确折叠需要分子伴侣

• 中心法则：DNA↔RNA→多肽链→蛋白

• 多肽链如何到有活性的蛋白仍不清楚
• 第二遗传密码：遗传信息从蛋白质中氨基酸序列到其空间结构之间的传递，折叠密码。
• 蛋白质边翻译边折叠。
• 多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础。

• 大多数蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助。

  几种有促进蛋白折叠功能的大分子

• 分子伴侣chaperone：防止错误折叠的发生；对已经发生错误折叠的蛋白质，分子伴侣识别并帮助其恢复正确的折叠；

• 蛋白质二硫键异构酶：催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接；

• 肽-脯氨酰顺反异构酶：顺反异构状态的转换

  分子伴侣

• 定义：分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。

• 分子伴侣的主要作用是：
  • 封闭待折叠肽链暴露的疏水区段；
  • 创建一个隔离的环境，可以使肽链的折叠互不干扰；
  • 促进肽链折叠和去聚集；
  • 遇到应激刺激，使已折叠的蛋白质去折叠。

• 细胞内分子伴侣可分为两大类

  • 一类为核糖体结合性分子伴侣，包括触发因子和新生链相关复合物；
  • 另一类为非核糖体结合性分子伴侣，包括热激蛋白、伴侣蛋白等。

    热激蛋白(heat shock protein, HSP)

• 热休克蛋白属于应激反应性蛋白质，高温应激可诱导该蛋白质合成。热休克蛋白可促进需要折叠的多肽折叠为有天然空间构象的蛋白质。

• 热休克蛋白包括HSP70、HSP40和GrpE(HSP60)三族。

• 蛋白质的折叠，HSP70还需HSP40和Grp E的辅助

  伴侣蛋白Gro EL和Gro ES

• 伴侣蛋白（chaperonin）是分子伴侣的另一家族，如大肠杆菌的Gro EL和Gro ES（真核细胞中同源物为HSP60和HSP10）等家族。

• 其主要作用是为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。

一级结构的修饰

• 肽链N端的修饰，切除Met或fMet
• 个别氨基酸的共价修饰
• 多肽链的水解修饰

空间结构的修饰

• 亚基聚合
• 辅基连接

• 疏水脂链的共价连接

  肽链中肽键水解产生多种功能肽

• 例：鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰

  氨基酸残基的化学修饰

• 增强蛋白质功能的多样性 | 常见的化学修饰种类 | 发生修饰的主要氨基酸残基 | | :—-: | :—-: | | 磷酸化 | 丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸 | | N-糖基化 | 天冬酰胺 | | O-糖基化 | 丝氨酸、苏氨酸 | | 羟基化 | 脯氨酸 赖氨酸 | | 甲基化 | 赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸 | | 乙酰化 | 赖氨酸、丝氨酸 | | 硒化 | 半胱氨酸 |

亚基聚合形成功能性蛋白质复合物

• 通过非共价键亚基聚合形成具有四级结构的蛋白质
  • 具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体(oligomer)。

• 辅基连接后形成完整的结合蛋白质

  • 结合蛋白质合成后都需要结合相应辅基，才能成为具有功能活性的天然蛋白质。

    蛋白质靶向输送

• 蛋白质在核蛋白体上合成后，必须分选出来，定向输送到一个合适的部位才能行使各自的生物学功能。蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。

• 靶向输送的蛋白质N-端存在信号序列
  • 所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要是N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这类序列称为信号序列(signal sequence)。
  • 信号序列是决定蛋白质靶向输送特性的最重要元件，提示指导蛋白质靶向输送的信息存在于蛋白质自身的一级结构中。
• 蛋白细胞亚组分分选信号 | 蛋白种类 | 信号序列 | 结构特点 | | :—-: | :—-: | :—-: | | 分泌蛋白和质膜蛋白 | 信号肽 | 15～30个氨基酸，位于N-端，中间为疏水性氨基酸 | | 核蛋白 | 核定位信号 | 4～8个氨基酸组成，位于内部，含Pro、Lys和Arg，典型序列为K-K/R-X-K/R | | 内质网蛋白 | 内质网滞留信号 | C-端的Lys-Asp-Glu-Leu （KDEL） | | 核基因组编码的线粒体蛋白 | 线粒体导肽 | 20～35个氨基酸，位于N-端 | | 溶酶体蛋白 | 溶酶体靶向信号 | 甘露糖-6-磷酸（Man-6-P） |

分泌型蛋白质在内质网加工转运

• 细胞内分泌型蛋白质的合成与转运同时发生。它们的N-端都有信号肽（signal peptide）结构，由数十个氨基酸残基组成。

• 信号肽有以下共性

  • N-端含1个或几个带正电荷的碱性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸；
  • 中段为疏水核心区，主要含疏水的中性氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸等；
  • C-端加工区由一些极性相对较大、侧链较短的氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸）组成，紧接着是被信号肽酶(signal peptidase)裂解的位点 。

    信号序列引导蛋白质进入内质网

    

    定位于内质网的蛋白质C-端含有滞留信号序列

• 内质网中含有多种帮助新生肽链折叠成天然构型的蛋白质，如分子伴侣等。与分泌型蛋白质一样，需要停留在内质网中执行功能的蛋白质先经粗面内质网上的附着核糖体合成并进入内质网腔，然后随囊泡输送到高尔基复合体。

  大部分线粒体蛋白质在细胞液合成后靶向输入线粒体

• 线粒体虽然含有DNA、核糖体、mRNA及tRNA等，可以进行蛋白质的生物合成，但绝大部分线粒体蛋白质是由核基因组编码、在胞液中的游离核蛋白体上合成后释放、靶向输送到线粒体中的。

  真核细胞线粒体蛋白质的靶向运输

  

  质膜蛋白质由囊泡靶向转运至细胞膜

• 质膜蛋白质合成时在粗面内质网上的跨膜机制与分泌型蛋白质的跨膜机制相似，但是，质膜蛋白质的肽链并不完全进入内质网腔，而是锚定在内质网膜上。

• 不同类型的跨膜蛋白质以不同的形式锚定于膜上。

  细胞核蛋白质由核输入因子运载经核孔入核

• 由核定位序列引导(NLS)

蛋白质生物合成的干扰与抑制

• 蛋白质生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶点。抗生素等就是通过阻断真核、原核生物蛋白质翻译体系某组分功能、干扰和抑制蛋白质生物合成过程而起作用的。

• 可针对蛋白质生物合成必需的关键组分作为研究新抗菌药物的作用靶点。同时尽量利用真核、原核生物蛋白质合成体系的任何差异，以设计、筛选仅对病原微生物特效而不损害人体的药物。

  许多抗生素通过抑制蛋白质生物合成发挥作用

• 抗生素(antibiotics)是一类由某些真菌、细菌等微生物产生的药物，有抑制其他微生物生长或杀死其他微生物的能力，对宿主无毒性的抗生素可用于预防和治疗人、动物和植物的感染性疾病。

• 常用抗生素抑制肽链生物合成的原理与应用 | 抗生素 | 作用位点 | 作用原理 | 应用 | | :—-: | :—-: | :—-: | :—-: | | 伊短菌素 | 原核、真核核蛋白体小亚基 | 阻碍翻译起始复合物的形成 | 抗病毒药 | | 四环素、土霉素 | 原核核蛋白体小亚基 | 抑制氨基酰-tRNA与小亚基结合 | 抗菌药 | | 链霉素、新霉素、巴龙霉素 | 原核核蛋白体小亚基 | 改变构象引起读码错误、抑制起始 | 抗菌药 | | 氯霉素、林可霉素、红霉素 | 原核核蛋白体大亚基 | 抑制转肽酶、阻断肽链延长 | 抗菌药 | | 嘌呤霉素 | 原核、真核核蛋白体 | 使肽酰基转移到它的氨基上后脱落 | 抗肿瘤药 | | 放线菌酮 | 真核核蛋白体大亚基 | 抑制转肽酶、阻断肽链延长 | 医学研究 | | 夫西地酸、
  细球菌素 | EF-G | 抑制EF-G、阻止转位 | 抗菌药 | | 壮观霉素 | 原核核蛋白体小亚基 | 阻止转位 | 抗菌药 |

某些毒素抑制真核生物蛋白质合成

白喉毒素

• 真核细胞蛋白质合成的抑制剂，它作为一种修饰酶，可使eEF-2发生ADP糖基化共价修饰，生成eEF-2腺苷二磷酸核糖衍生物，使eEF-2失活。

  蓖麻蛋白(ricin)

• 蓖麻籽中的糖蛋白，含A、B多肽链。

• A链是一种蛋白酶，可作用于真核生物核蛋白体大亚基的28S rRNA，催化其中特异腺苷酸发生脱嘌呤基反应，使28S rRNA降解，使核蛋白体大亚基失活；

• B链对A链发挥毒性具有重要的促进作用，且B链上的半乳糖结合位点也是毒素发挥毒性作用的活性部位。

  干扰素抑制蛋白质合成

• 干扰素(interferon, IFN)是真核细胞被病毒感染后分泌的一类具有抗病毒作用的蛋白质，可抑制病毒的繁殖。

• 干扰素分为α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型和γ-（淋巴细胞）型三大类，每类各有亚型，分别具有其特异作用。
• 干扰素抑制病毒的作用机制有两幅
  • 一是干扰素在某些病毒双链RNA存在时，能诱导特异的蛋白激酶活化，该活化的蛋白激酶使eIF-2磷酸化而失活，从而抑制病毒蛋白质合成；
  • 二是干扰素能与双链RNA共同活化特殊的2’-5’寡聚腺苷酸（2’-5’A）合成酶，催化ATP聚合，生成单核苷酸间以2’-5’磷酸二酯键连接的2’-5’A，经2’-5’A活化核酸内切酶RNase L，后者可降解病毒mRNA，从而阻断病毒蛋白质合成。
• 干扰素诱导eIF2磷酸化而失