DNA的复制

  • 复制(replication) 是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。
  • DNA复制的主要特征
    • 半保留复制 (semi-conservative replication)
    • 双向复制 (bidirectional replication)
    • 半不连续复制 (semi-discontinuous replication)

DNA以半保留方式进行复制

  • 在复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链

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  • 半保留复制的意义
    • 依据半保留复制的方式，子代DNA中保留了亲代的全部遗传信息，亲代与子代DNA之间碱基序列的高度一致
    • 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的

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DNA复制从起始点双向进行

  • 原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制

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  • 真核生物每个染色体又有多个起点，呈多起点双向复制特征。每个起点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域称为复制子（replicon）。复制子是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位


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    DNA复制以半不连续方式进行

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    DNA复制的酶学和拓扑学

  • 参与DNA复制的物质

    • 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP
    • 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol
    • 模板(template): 解开成单链的DNA母链
    • 引物(primer): 提供3’-OH末端使dNTP可以依次聚合
      • 引物酶：引物是引物酶催化合成的短链RNA分子
    • 其他的酶和蛋白质因子
  • 新链的延长只可沿5’-3’方向进行
  • DNA新链生成需RNA引物和DNA聚合酶

DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合

  • 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)
  • 简称：DNA-pol
  • 功能：
    • 聚合作用：在引物RNA-OH末端,以dNTP为底物,按模板DNA上的指令,即A与T,C与G的配对原则,逐步逐个、连续地将dNTP加到延伸中的DNA分子3-OH末端,逐步合成延长中的子链DNA。这是DNA聚合酶的主要作用
    • 校对作用：从3’→5’方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸
    • 切除修复作用：该活性是从5’→3’方向水解DNA延长链前方的DNA链(即只对DNA上双链处的磷酸二酯键有切割作用),主要产生5—脱氧核苷酸。在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。
  • 活性
    • 5’-3’的聚合活性
    • 核酸外切酶活性

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  • 原核生物至少有5种DNA聚合酶
    • DNA-polⅠ
    • DNA-polⅡ
    • DNA-pol Ⅲ
    • DNA-pol Ⅳ
    • DNA-pol Ⅴ
  • 原核生物的DNA聚合酶 | | DNA-pol Ⅰ | DNA-pol Ⅱ | DNA-pol Ⅲ | | —- | —- | —- | —- | | 分子量（kD） | 109 | 120 | 250 | | 组成 | 单肽链 | ？ | 多亚基不对称二聚体 | | 分子数/细胞 | 400 | ？ | 20 | | 5’->3’ 核酸外切酶活性 | 有 | 无 | 无 | | 3’->5’ 核酸外切酶活性 | 有 | 有 | 无 | | 5’->3’聚合酶活性 | 有 | 无 | 有 | | 基因突变后的致死性 | 可能 | 不可能 | 可能 |

DNA聚合酶III全酶结构

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  • 核心酶由∂、ß和θ亚基组成
    • ∂亚基（130000）主要功能是合成DNA
    • ß亚基具有3’-5’外切酶活性（复制保真性所必需）ß亚基可增强其活性
    • θ亚基可能起组装作用
  • 两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用

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DNA聚合酶I

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DNA聚合酶II

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常见的真核细胞DNA聚合酶有5种

DNA-pol ∂ 起始引发，有引物酶活性
DNA-pol ß 参与低保真度的复制
DNA-pol γ 在线粒体DNA复制中起催化作用
DNA-pol δ 合成后随链
DNA-pol ε 合成前导链


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DNA聚合酶的碱基选择和校对功能

  • DNA复制的保真性至少要依赖三种机制
    • 遵守严格的碱基配对规律
    • 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能
    • 复制出错时有即时校对功能

复制的保真性依赖正确的碱基选择

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聚合酶的核算外切酶活性在复制中辨别切除错配碱基并加以校正

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复制DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

多种酶参与DNA解链和稳定单链状态

原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白质

蛋白质（基因） 通用名 功　　能
DnaA（dnaA） 辨认复制起始点
DnaB（dnaB） 解旋酶 解开DNA双链
DnaC（dnaC） 运送和协同DnaB
DnaG（dnaG） 引发酶 催化RNA引物生成
SSB 单链结合蛋白/DNA结合蛋白 稳定已解开的单链DNA
拓扑异构酶 拓扑异构酶Ⅱ又称促旋酶 解开超螺旋

相关酶的参与

  • 解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链
  • 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA引物的酶

  • 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性

    正超螺旋的形成

  • 正常DNA螺旋为负超螺旋，正超螺旋形成后，会相应的形成负超螺旋抵抗

  • 环状正超螺旋-(单链被剪切)->环状-(完整剪切)->链状

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拓扑异构酶

  • 拓扑异构酶作用特点:
    • 既能水解 、又能连接磷酸二酯键
  • 拓扑异构酶分类及作用机制
    • 拓扑异构酶Ⅰ：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP
    • 拓扑异构酶Ⅱ：切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态

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DNA连接酶连接复制中产生的单链切口

DNA连接酶(DNA ligase)作用方式

  • 连接DNA链3’-OH末端和相邻DNA链5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链
  • 通常只作用在单链
  • 功能
    • DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用
    • 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用
    • 也是基因工程的重要工具酶之一

T4连接酶(T4 ligase)

  • 是一种能连接双链的酶，可催化磷酸

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原核生物DNA复制过程

  • 起始
  • 延长
  • 终止

复制的起始

  • 起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物
  • 需要解决两个问题
    • DNA解开成单链，提供模版
    • 形成引发体，合成引物，提供3’-OH末端

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复制的延伸

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复制的终止

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真核生物DNA复制过程

  • 真核生物与原核生物DNA复制的差异
    • 真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等
    • DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶转换
    • 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等

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真核生物复制的起始与原核基本相似

  • 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步启动
  • 复制的起始需要DNA-pol α（引物酶活性）、还需解螺旋酶、拓扑酶和复制因子

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真核DNA复制中主要蛋白质的功能
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真核生物复制的延长发生DNA聚合酶转换

  • 现在认为pol α主要催化合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol δ和DNA pol ε所替换，这一过程称为聚合酶转换。DNA pol δ负责合成后随链，DNA pol ε负责合成前导链。

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真核生物DNA合成后立即组装成核小体

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端粒酶参与解决染色体末端复制问题

  • 染色体DNA呈线状，复制在末端停止
  • 复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接
  • 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙

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端粒(telomeres)

  • 端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成
  • 人的端粒重复序列为5’-(TnGn)x-3’ TTAGGG,长为15kb
  • 这些重复序列多为双链，但每个染色体的3’端比5’端长，形成ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题
  • 体细胞端粒有限长度(TRFS)大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂衰老
  • 端粒末端回折结构

端粒酶(telomerase)

  • 组成
    • 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)
    • 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)
    • 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)
  • 端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成
  • 端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3’端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体的3’端。这些新合成的DNA为单链

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真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次

  • 真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次

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真核生物线粒体DNA按D环方式复制

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逆转录

逆转录病毒的基因组以逆转录机制复制

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  • 逆转录酶中还包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、RNA水解酶的活性

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  • RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因
  • cDNA-逆转录DNA

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能形成磷酸二酯键的酶

酶名 酶作用
DNA聚合酶

以dNTP为底物，遵照碱基互补配对原则，以DNA单链为模版按碱基互补配对原则从5’到3’端通过磷酸二酯键合成子链DNA，起DNA聚合作用
RNA聚合酶

是以一条DNA链或RNA为模板，三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶
拓扑异构酶

拓扑异构酶Ⅰ：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP
拓扑异构酶Ⅱ：切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态
引物酶

引物酶是用来引导RNA引物/引子(RNA primer)的合成，从而引导DNA聚合酶介导的DNA链的合成。
端粒酶

端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成。端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3’端ssDNA（后随链模板）为引物，以磷酸二酯键形式合成单链DNA，并以此将端粒序列添加于染色体的3’端。
DNA连接酶

连接DNA链3’-OH末端和相邻DNA链5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链
逆转录酶

该酶以RNA为模板，以dNTP为底物，tRNA( 主要是色氨酸tRNA) 为引物，tRNA3’-OH 末端上，根据碱基配对的原则，按5’-3’方向以磷酸二酯键方式合成一条与RNA模板互补的DNA单链