1. 介绍
1.1 原理
PacBio（Pacific Biosciences）公司的单分子实时测序（Single Molecular Real Time Sequencing, SMRT Sequencing），
高分子量（HMW）gDNA
加上接头构建SMRTbell文库，将引物和聚合酶添加到已经准备好测序的文库中。
https://www.youtube.com/watch?v=_lD8JyAbwEo
每张SMRT Cell芯片包含数百万个称为零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）的微小单元，将单个DNA分子固定在ZMWs中，随着聚合酶掺入标记的核苷酸，就会发出荧光。使用这种方法，可以实时检测核苷酸的掺入。使用Squel II系统，可以通过两种测序模式优化结果：
- Circular Consensus Sequencing（CCS，环化共有序列模式）可以产生高精度的长读长测序结果，称为HiFi测序。
- Continuous Long Read （CLR，连续的长读长测序模式）Sequencing生成尽可能长的测序结果。
https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/
CCS reads：每个ZMW内产生的Subreads所生成的一致性序列
1.2 平台
Iso-Seq：全长转录组测序，应用平台RS II
平台：RSII、Squel、Squel II、Squel IIe
Squel IIe除了能够直接产出长读长，高准确性的HiFi reads外，还能同时呈现CpG岛中5mC甲基化修饰。PacBio HiFi测序的5mC的读序无需重亚硫酸盐处理，也无需额外的文库制备，直接通过HiFi测序即可获得。
另外，HiFi用于5mC的检测与读序保留了基因组表观遗传修饰信息的定相（phasing）数据。这将揭示等位基因特异性甲基化的模式，可直接找到来自遗传变异（表观遗传状态受序列差异影响）或亲本印记（表观遗传状态受染色体遗传自母亲还是父亲的影响）所带来的的影响。
https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/sequel-system/
1.3 优点
PCR free
2. 实验流程
2.1 样品制备
2.1.1 DNA提取
DNA提取试剂盒
2.1.2 DNA样品质控
定性
定量
纯度
2.2 文库构建
金属浴
DNA片段回收
2.3 测序
2.4 数据分析
https://www.pacb.com/technology/hifi-sequencing/
PacBio bioinformatics file formats
PacBio BAM文件
PacBio sequel下机是bam格式的reads文件，它和reads比对到参考基因组上生成的bam文件内容有差异，但格式一致。
bam文件主要分成两个部分，头一部分是Header，存储测序的相关信息，另一部分是records，是文件的主要部分，这里头保存了序列信息。
https://github.com/PacificBiosciences/ccs
参考
公众号 | 基因售后服务 | #PacBio 技术专题（From DNA to Discovery – SMRT测序技术概览）
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