基本分析

在本节中，我们将使用immunarch包中的基本函数对免疫组库数据进行常规分析。

常用函数如下：

  • repExplore- 计算基本统计数据，例如克隆数或长度和计数的分布。要探索它们，您需要将统计信息如“count”传递给.method参数.
  • repClonality - 计算TCR/BCR库的克隆性。
  • repOverlap - 计算不同TCR/BCR库的重叠性。
  • repOverlapAnalysis - 分析TCR/BCR库的重叠，包括不同的聚类程序和 PCA。
  • geneUsage - 计算V或J基因的分布。
  • geneUsageAnalysis - 分析V或J基因的分布，包括聚类和PCA。
  • repDiversity - 估计TCR/BCR库的多样性。
  • trackClonotypes - 分析跨时间点的TCR/BCR库动态。
  • spectratype - 计算克隆型的谱型。
  • getKmers和kmer_profile- 计算 kmers 和序列配置文件的分布。

可视化分析结果

在immunarch中，每个函数的分析结果都可以直接传递给vis函数进行可视化，它是一个通用的可视化函数。同时，我们还可以通过.by参数传递任一分组变量，或同时将.by和.meta参数传递给 vis函数来进行分组展示。

    1. 我们可以通过.by参数将元数据表中的一个或多个列名称作为字符向量传递，以便在绘图之前对数据进行分组。在这种情况下，您还应该提供.meta元数据表的参数。
  1. exp_vol <- repExplore(immdata$data, .method = "volume")
  2. #         Sample Volume
  3. # A2-i129 A2-i129   6443
  4. # A2-i131 A2-i131   6375
  5. # A2-i133 A2-i133   6300
  6. # A2-i132 A2-i132   6721
  7. # A4-i191 A4-i191   5058
  8. # A4-i192 A4-i192   5763
  10. p1 <- vis(exp_vol, .by = c("Status"), .meta = immdata$meta)
  11. p2 <- vis(exp_vol, .by = c("Status", "Sex"), .meta = immdata$meta)
  12. # p1 + p2

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图1

    1. 我们还可以将.by字符向量作为与数据中样本数量完全匹配的字符向量传递，每个值应对应于一个样本的属性。它将用于根据提供的值对数据进行分组。请注意，在这种情况下，您应该将 NA 传递给.meta.
  1. exp_vol <- repExplore(immdata$data, .method = "volume")
  2. by_vec <- c("C", "C", "C", "C", "C", "C", "MS", "MS", "MS", "MS", "MS", "MS")
  3. p <- vis(exp_vol, .by = by_vec)
  4. p

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图2

当数据被分组后，immunarch包会默认执行组间均值比较的统计检验，除非设置参数.test = F。如果只有两个组，则执行Wilcoxon 秩和检验（wilcox.test带有参数的R 函数exact = F）以测试两组之间的平均秩值是否存在差异。如果有两个以上的组，则执行Kruskal-Wallis 检验（R 函数kruskal.test），这相当于秩合方差分析，它测试来自不同组的样本是否来自同一分布。一个显著的 Kruskal-Wallis 检验结果表明至少一个样本随机地支配另一个样本。多重比较调整后的 P 值绘制在组的顶部。P 值调整是使用Holm 方法（也称为 Holm-Bonferroni 校正）。您可以[?p.adjust](https://rdrr.io/r/stats/p.adjust.html)在 R 控制台中执行该命令以查看更多信息。

该vis函数生成的图以及任何基于 ggplot2 的图都可以传递给 —fixVis内置交互式可视化工具，用于制作可发表的图：

  1. # 1. Analyse
  2. exp_len <- repExplore(immdata$data, .method = "len", .col = "aa")
  3. #  Sample Length Count
  4. # 1 A2-i129      6     1
  5. # 2 A2-i129      9     6
  6. # 3 A2-i129     10    36
  7. # 4 A2-i129     11   243
  8. # 5 A2-i129     12   517
  9. # 6 A2-i129     13  1081
  11. # 2. Visualise
  12. p1 <- vis(exp_len)
  14. # 3. Fix and make publication-ready results
  15. fixVis(p1)

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图3

探索性可视化分析

对于基本的探索性分析，例如比较每个曲目的读取数/UMI 或分布，请使用该函数repExplore。

  1. exp_len <- repExplore(immdata$data, .method = "len", .col = "aa")
  2. head(exp_len)
  3. #   Sample Length Count
  4. # 1 A2-i129      6     1
  5. # 2 A2-i129      9     6
  6. # 3 A2-i129     10    36
  7. # 4 A2-i129     11   243
  8. # 5 A2-i129     12   517
  9. # 6 A2-i129     13  1081
  11. exp_cnt <- repExplore(immdata$data, .method = "count")
  12. head(exp_cnt)
  13. #   Sample Clone.num Clonotypes
  14. # 1 A2-i129         1       5858
  15. # 2 A2-i129         2        388
  16. # 3 A2-i129         3         86
  17. # 4 A2-i129         4         26
  18. # 5 A2-i129         5         25
  19. # 6 A2-i129         6          6
  21. exp_vol <- repExplore(immdata$data, .method = "volume")
  22. head(exp_vol)
  23.  #        Sample Volume
  24. # A2-i129 A2-i129   6443
  25. # A2-i131 A2-i131   6375
  26. # A2-i133 A2-i133   6300
  27. # A2-i132 A2-i132   6721
  28. # A4-i191 A4-i191   5058
  29. # A4-i192 A4-i192   5763
  31. p1 <- vis(exp_len)
  32. p2 <- vis(exp_cnt)
  33. p3 <- vis(exp_vol)
  35. p1

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图4

  1. p2 + p3

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图5

  1. # You can group samples by their metainformation
  2. p4 <- vis(exp_len, .by = "Status", .meta = immdata$meta)
  3. p5 <- vis(exp_cnt, .by = "Sex", .meta = immdata$meta)
  4. p6 <- vis(exp_vol, .by = c("Status", "Sex"), .meta = immdata$meta)
  6. p4

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图6

  1. p5 + p6

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图7

克隆性分析

估计样本多样性的方法之一是评估克隆性。repClonality函数可以计算最频繁或最不常见的克隆型的数量。有几种方法可以评估克隆性，让我们来看看它们。该clonal.prop方法计算细胞克隆池占据的所有库的比例：

  1. imm_pr  <-  repClonality ( immdata$data , .method  =  "clonal.prop" )
  2. imm_pr
  3. ##         Clones Percentage Clonal.count.prop
  4. ## A2-i129     18       10.0      0.0027556644
  5. ## A2-i131     28       10.0      0.0042728521
  6. ## A2-i133      9       10.3      0.0014077898
  7. ## A2-i132    113       10.0      0.0164987589
  8. ## A4-i191      4       11.5      0.0007773028
  9. ## A4-i192      8       10.4      0.0013738623
  10. ## MS1          2       10.1      0.0003700278
  11. ## MS2         66       10.0      0.0092372288
  12. ## MS3          2       10.6      0.0003095496
  13. ## MS4        176       10.0      0.0236336780
  14. ## MS5          3       13.2      0.0005303164
  15. ## MS6        150       10.0      0.0202456472
  16. ## attr(,"class")
  17. ## [1] "immunr_clonal_prop" "matrix"

该top方法考虑了最丰富的细胞克隆型：

  1. imm_top <- repClonality(immdata$data, .method = "top", .head = c(10, 100, 1000, 3000, 10000))
  2. imm_top
  3. ##                 10        100      1000      3000 10000
  4. ## A2-i129 0.08011765 0.17282353 0.3491765 0.5844706     1
  5. ## A2-i131 0.06670588 0.15647059 0.3467059 0.5820000     1
  6. ## A2-i133 0.10505882 0.18294118 0.3655294 0.6008235     1
  7. ## A2-i132 0.02388235 0.09423529 0.3118824 0.5471765     1
  8. ## A4-i191 0.17176471 0.32047059 0.5122353 0.7475294     1
  9. ## A4-i192 0.11541176 0.22141176 0.4325882 0.6678824     1
  10. ## MS1     0.19164706 0.30894118 0.4817647 0.7170588     1
  11. ## MS2     0.04458824 0.11470588 0.2770588 0.5123529     1
  12. ## MS3     0.16482353 0.23011765 0.3575294 0.5928235     1
  13. ## MS4     0.02329412 0.07517647 0.2415294 0.4768235     1
  14. ## MS5     0.20611765 0.29188235 0.4521176 0.6874118     1
  15. ## MS6     0.02835294 0.08235294 0.2460000 0.4812941     1
  16. ## attr(,"class")
  17. ## [1] "immunr_top_prop" "matrix"

该rare方法处理丰度最低的克隆型：

  1. imm_rare <- repClonality(immdata$data, .method = "rare")
  2. imm_rare
  3. ##                 1         3        10        30       100 MAX
  4. ## A2-i129 0.6991765 0.8215294 0.8710588 0.9267059 0.9604706   1
  5. ## A2-i131 0.6969412 0.8243529 0.8995294 0.9436471 0.9869412   1
  6. ## A2-i133 0.6800000 0.8100000 0.8690588 0.8974118 0.9357647   1
  7. ## A2-i132 0.7088235 0.8831765 0.9643529 0.9951765 1.0000000   1
  8. ## A4-i191 0.5355294 0.6484706 0.7189412 0.7707059 0.8697647   1
  9. ## A4-i192 0.5976471 0.7487059 0.8342353 0.8675294 0.9156471   1
  10. ## MS1     0.5780000 0.6692941 0.7438824 0.7929412 0.8571765   1
  11. ## MS2     0.7788235 0.8891765 0.9322353 0.9718824 1.0000000   1
  12. ## MS3     0.7272941 0.7825882 0.8071765 0.8385882 0.8652941   1
  13. ## MS4     0.8109412 0.9343529 0.9725882 1.0000000 1.0000000   1
  14. ## MS5     0.6112941 0.7001176 0.7575294 0.7809412 0.8284706   1
  15. ## MS6     0.8107059 0.9208235 0.9703529 0.9897647 1.0000000   1
  16. ## attr(,"class")
  17. ## [1] "immunr_rare_prop" "matrix"

最后，该homeo方法评估克隆空间稳态，即给定大小的克隆占据的TCR/BCR库的比例：

  1. imm_hom <- repClonality(immdata$data,
  2.   .method = "homeo",
  3.   .clone.types = c(Small = .0001, Medium = .001, Large = .01, Hyperexpanded = 1)
  4. )
  5. imm_hom
  6. ##         Small (0 < X <= 1e-04) Medium (1e-04 < X <= 0.001)
  7. ## A2-i129                      0                   0.8634118
  8. ## A2-i131                      0                   0.8858824
  9. ## A2-i133                      0                   0.8597647
  10. ## A2-i132                      0                   0.9542353
  11. ## A4-i191                      0                   0.7135294
  12. ## A4-i192                      0                   0.8183529
  13. ## MS1                          0                   0.7248235
  14. ## MS2                          0                   0.9244706
  15. ## MS3                          0                   0.8061176
  16. ## MS4                          0                   0.9683529
  17. ## MS5                          0                   0.7520000
  18. ## MS6                          0                   0.9625882
  19. ##         Large (0.001 < X <= 0.01) Hyperexpanded (0.01 < X <= 1)
  20. ## A2-i129                0.09705882                    0.03952941
  21. ## A2-i131                0.09011765                    0.02400000
  22. ## A2-i133                0.07600000                    0.06423529
  23. ## A2-i132                0.04576471                    0.00000000
  24. ## A4-i191                0.15623529                    0.13023529
  25. ## A4-i192                0.08611765                    0.09552941
  26. ## MS1                    0.12082353                    0.15435294
  27. ## MS2                    0.06411765                    0.01141176
  28. ## MS3                    0.05917647                    0.13470588
  29. ## MS4                    0.03164706                    0.00000000
  30. ## MS5                    0.07647059                    0.17152941
  31. ## MS6                    0.03741176                    0.00000000
  32. ## attr(,"class")
  33. ## [1] "immunr_homeo" "matrix"
  1. vis(imm_top) + vis(imm_top, .by = "Status", .meta = immdata$meta)

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图8

  1. vis(imm_rare) + vis(imm_rare, .by = "Status", .meta = immdata$meta)

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图9

  1. vis(imm_hom) + vis(imm_hom, .by = c("Status", "Sex"), .meta = immdata$meta)

使用immunarch包进行单细胞免疫组库数据分析（四）：Basic analysis and clonality - 图10

参考来源：https://immunarch.com/articles/web_only/v3_basic_analysis.html