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    哈喽！大家好！我是鲸舟基因的吉祥物 — 普鲸，我是一只调皮可爱的小精灵，我的皮肤是蓝色的，我的背上纹了一朵大大的花瓣，嗯，这就是我。今天小编邀请中科普瑞科研服务微信号推出了十问十答系列专题，本专题是关于 850K DNA 甲基化芯片检测的常见问题，以后会推出系列知识，欢迎前来围观吃瓜！

    想了解 Illumina 850K 芯片的知识

    Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip 芯片（850K 芯片），为研究者提供了一个可靠且经济高效的甲基化分析平台。并为 FFPE 样本的检测改进了 protocol，以获得更可靠和稳定的结果。广泛应用于干细胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究，是目前最适合表观基因组全关联分析研究的全基因组 DNA 甲基化芯片。

    一、Illumina 850K 芯片有哪些技术特点？

    1. 全面的基因组覆盖范围：检测 > 853,000 个 CpG 位点，全面覆盖 CpG 岛、启动子、编码区、开放染色质和增强子，此外还包括 CpG 岛外的 CpG 位点，已知 DMR 位点，脱氧核糖核酸酶超敏位点以及 miRNA 启动子区域；

    2. 高质量的数据：同时采用 Infinium I 及 II 探针设计，使检测范围最大化；

    3. 分辨率高：单碱基分辨率，可以直接检测到发生甲基化的确切位点；

    4. 可重复性高： 自身技术重复相关性 R2 > 0.98，850K vs 450K 交集探针间相关性 R2 > 0.98；

    5. 起始模板量低：仅需 250ng，大大节约了样品量；

    6. 检测样本类型更广：不仅可以检测全血、细胞、新鲜 / 新鲜冷冻的组织、而且也可检测 FFPE 样本。

    二、 Illumina 850K 芯片样本要求？

    1. 样品类型：组织、细胞、基因组 DNA；

    2. 样品纯度：OD 260/280 值应在 1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净，不得有其它个体或其它物种的 DNA 污染；

    3. 样品总量：每个样品总量推荐 600 ng 以上 ；

    4. 样品溶剂：溶解在 TE 中；

    5. 样品运输： DNA 低温运输（-20℃），在运输过程中请用 parafilm 将管口密封好，以防出现污染。

    三. 850K 芯片能不能用来检测羟甲基化？

    可以，一份样本需要分成两份处理，其中一份用高钌酸钾处理后，再用亚硫酸盐处理。

    BS 转化后可获得 5mC 和 5hmC，而 KRu04 处理之后获得 5mC，两者之间做差就可以得到 5hmC。

    四. 850k、WGBS、RRBS 和 DNA 甲基化捕获测序有什么区别？

    850K DNA甲基化芯片检测必须知道的十问十答 - 图1

    五. 什么情况下选择做 850K 芯片？

    1. 物种是人；

    2. 需要甲基化分析分辨率达到单碱基水平。

    六. DNA 甲基化芯片数据可以进行哪些方向的分析研究？

    DNA 甲基化数据用于科研研究，主要有两种常见数据分析方向：

    1. 常规组间差异比较，通过比较组见甲基化的差异程度来寻找组间差异甲基化位点，通常适合样本量比较少的组间分析。配合生物统计学 p_value 统计，筛选组间具有显著性差异的甲基化位点；

    2. 全基因组关联分析（EWAS）研究，适合大样本群体（500 对以上），通过表型数据与芯片位点数据的关联分析，寻找和特定表型相关的关联位点。

    七. DNA 甲基化与多组学研究的关系？

    DNA 甲基化数据表观遗传研究范畴，现有研究发现，DNA 甲基化对基因转录调控有影响，特别是基因启动子区域高甲基化将抑制基因表达，最新的研究也发现，基因 body 区，高甲基化激活基因转录。因此，将 DNA 甲基化与转录组学结合起来进行研究，可解释 DNA 甲基化变化对基因转录的影响，进而对细胞功能的影响。基因组 SNP 多态性位点附近如果存在甲基化位点，该位点可能会影响 DNA 甲基化状态。通过将 SNP 与甲基化结合起来，通过 mQTL 分析，可找到与某基因甲基化水平显著相关的 SNP 位点，进而可以通过 SNP - 甲基化 - 表型的角度进行研究。

    八. 高通量甲基化芯片检测后，如何筛选候选差异位点进行后续研究？

    850K 芯片能一次性检测 86 w 多个 CpG 位点，在通常情况下，实验组与对照组分析结果会得到成千，上万的差异。在这么多位点中，筛选后续重点验证的位点可有以下几种方式：

    1. 根据注释信息，优先选择研究领域中的已知基因，如果这些基因的不同区域有差异甲基化位点出现，优先选择；

    2. 根据差异位点所在基因的 GO 与 KEGG 功能富集结果，筛选跟本研究领域相关的信号通路基因，根据这部分结果筛选差异位点；

    3. 通过以上两种方式，筛选到的差异位点，优先选择位于 Island 区域，启动子区域，body 区也可以考虑，同一个区域中有多个差异位点最理想；

    基于以上的结果，选择差异β值大的位点进行后续的验证工作。

    九. DNA 甲基化后续验证工作需要注意哪些问题？

    1. 验证方法：现有研究结果中，以焦磷酸测序方法进行验证的相对较多；

    2. 样本选择：通过 DNA 甲基化芯片筛选到的位点，首先对做芯片的样本进行验证，结果吻合后再扩大样本进行验证。

    十. DNA 甲基化高通量研究，样本多少比较合理？

    1. 细胞样本，3 个以上；

    2. 临床组织样本 5 例以上；

    3. 血液类样本 10 例以上；

    4.EWAS 研究 500 例以上。

    中科普瑞下设全资子公司上海鲸舟基因科技有限公司 / 上海鲸舟医学检验所，立足新一代测序及其衍生技术，以医学生物信息学为核心，提供覆盖肿瘤分子病理诊断，用药指导和预后预测，早期筛查、甲基化研究和应用、单细胞研究和应用、新型病原微生物感染、重大疾病风险评估、多组学科技服务等综合解决方案。
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