摘自：白墨，知乎【https://zhuanlan.zhihu.com/p/166500744】

一、什么是染色质可及性？

染色质关闭：压缩DNA
image.png
人的DNA链全部展开大约有2m，需要折叠为染色质结构才可以存储到放到细胞核中。染色质的基本结构单位是核小体（由组蛋白组成），核小体再折叠最终形成高度压缩的染色质结构。一般真核生物是这种方式来存储遗传信息。

这个过程像我们将文件压缩为zip或者rar的压缩包，减少它的占用空间。
染色质开放：解压DNA
image.png
高度折叠的染色质结构在复制和转录时需要暴露出DNA序列，这段暴露的区域就是染色质开发区域，这个区域可以供转录因子和其他调控元件结合，所以它与转录调控是密切相关的。这种致密的核小体结构被破坏后，启动子、增强子、绝缘子、沉默子等顺式调控元件和反式作用因子可以接近的特性，叫染色质的可及性，也叫染色质开放性(chromatin accessibility ），这段区域叫开放染色质（open chromatin）。
这个过程类似于我们要查看刚刚压缩包里的文件，我们需要解压后才能查看到文件里的内容。

二、检测染色质可及性

为了研究染色质的这种特性，大家都先后尝试了好多测序来检测染色质可及性。但是目前最常用的是2013年由斯坦福大学William J. Greenleaf和Howard Y. Chang实验室开发的ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing），一种捕获染色质可及性（染色质开放性）的测序方法。

1. 原理

利用转座酶Tn5可结合开放染色质的性质，使用Tn5酶捕获DNA序列，进而上机测序。
转座酶会携带特定的已知序列，然后将这些序列插入到开放的染色质区域中，最后将带有转座酶标记过的序列上机测序，通过软件计算，就能获得基因组哪些地方是开放的。

image.png

开放染色质的研究方法除了ATAC-seq，还有DNase-Seq，FAIRE-seq，MNase-seq 等。ATAC-Seq由于其所需样本少，建库快，重复性更高，是目前研究开发染色质的主流技术方法。

2. 应用

  • 染色质开放性图谱绘制
  • 找调控生物学过程的关键转录因子
  • 找哪个转录因子调控了研究的基因

  • 找转录因子调控的靶基因

    3. 技术限制

  • Tn5通过插入剪断DNA 并将测序接头连接到剪断的两个DNA 片段的末端，因此对于一个DNA 片段而言，其两端的接头连接是随机的，这便导致同一片段两端的接头有50%的概率是同一接头。而只有连接不同接头的片段才可用于富集扩增及测序，因此，有一半的片段无法利用；

  • 大量剪断的DNA 由于片段过大，无法进行PCR富集;
  • Tn5 的活性受反应溶液的组成及反应条件影响，仍然需要优化以便提高剪切效果；

  • ATAC-seq在植物细胞中存在以下难点：细胞壁的存在，叶绿体、线粒体等细胞器的污染，缺少稳定遗传的细胞系;

    三、相似测序方法的异同

    1. ATAC-Seq、ChIP-Seq、Dnase-Seq、MNase-Seq、FAIRE-Seq 比较

    这些测序方法整体的分析思路一致，找到富集区域，对富集区域进行功能分析。
    ChIP-Seq是揭示特定转录因子或蛋白复合物的结合区域，实际是研究DNA和蛋白质的相互作用，利用抗体将蛋白质和DNA一起富集，并对富集到的DNA进行测序。
    DNase-Seq、ATAC-Seq、FAIRE-Seq都是用来研究开放染色质区域：
    DNase-Seq是用的DNase I内切酶识别开放染色质区域，
    ATAC-seq是用的Tn5转座酶，随后进行富集和扩增；
    FAIRE-Seq是先进行超声裂解，然后用酚-氯仿富集；
    MNase-Seq是用来鉴定核小体区域。
    下图是不同测序方法获取的峰形：
    image.png

    2. ChIP-seq 与 ATAC-seq 的比较

    image.png

  • 峰形状的区别

Chip-seq与ATAC-seq 的 peaks 有着明显的区别，前者peaks是代表抗体结合转录因子的位点，后者peaks是代表Tn5转座酶切开染色质开放区的两端，因此在一个位置，前者peaks有一个，后者有两个。

  • 在应用上的区别

ATAC-Seq是可以检测到全基因组的DNA结合蛋白，转录结合位点 ，一般用于不知道特定的转录因子，用此方法与其他方法结合筛查感兴趣的特定调控因子；
ChIP-Seq是已知转录因子是什么，根据感兴趣的转录因子设计抗体去做ChIP实验富集它结合的DNA片段。在测定转录因子的 ChIP-seq 中独有的峰可能是先驱转录因子，其先结合到封闭染色质，然后招募染色质重塑因子或其他转录因子来起始转录。 这些转录因子 ATAC-seq是检测不到的。

  • 整合分析

由于开放染色质是大多数TF结合的先决条件，因此ATAC-seq峰通常与TF ChIP-seq峰重叠，但通常更宽。因此，TF ChIP-seq和ATAC-seq可以在同一实验系统中相互验证彼此的质量和可靠性。
ATAC-seq与 histone marker ChIP-seq集成，发现与活跃染色质标 H3K4me3，H3K4me1，H3K27ac等正相关，与不活跃的染色质标记 H3K27me3 负相关。

参考：