在准备NGS文库的时候，会有用到转座酶Tn5，Nextera DNA Library Preparation Kit ，比如ATAC-seq就有用到这个Tn5。转座酶携带有特定的序列称为转座子Transposon。

下面是ATAC-seq的工作原理，想必听说过ATAC-seq的，对这个图都会再熟悉不过了。
Tn5是kit里面带有的，没什么大不同。ATAC-seq 的barcoded primers （adaptors）会有一些不同，接下来，看下图中的每段序列对应的sequnce都是什么。
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下面图例，Nextera tn5用来给基因组DNA加adaptors。
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放大Tn5:
在tn5二聚体里面的双链的Oligo是Nextera Tn5 binding site，19个碱基，全部都是一样的。伸出来的部分是单链的序列，蓝色：Nextera tn5 read1 (5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’)；红色：Nextera tn5 read2(5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3’)
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  1. Nextera Tn5 binding site (19-bp Mosaic End (ME)): 5'- AGATGTGTATAAGAGACAG -3’
  2. Nextera N/S5xx primer entry point (s5)／Tn5 Read 1: 5'- TCGTCGGCAGCGTC -3'
  3. Nextera N7xx primer entry point (s7)／ Tn5 Read 2: 5'- GTCTCGTGGGCTCGG -3'
  5. Illumina P5 primer 1: 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC -3'
  6. Illumina P7 primer 2: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -3’
  7. Tn5 Read 1 （包括ME）sequence: 5'- TCGTCGGCAGCGTC（AGATGTG，TATAAGAGACAG） -3’ （33bp）
  8. Tn5 Read 2 （包括ME）sequence: 5'- GTCTCGTGGGCTCGG（AGATGT，GTATAAGAGACAG ）-3’ （34bp）

下面的图片就是准备ATAC-seq时候需要用到的index primer （adaptor），和Nextera DNA library prep kit里的有一点类似，但是也很不同。Ad1_noMX是Forward 引物，没有index （barcode），所以只有一个。Reversed引物有24个Ad2.（1-24），所以有24组不同的index （barcode）序列。这个index序列是和Nextera一样的。我涂红色部分就是index序列的反向反义序列，每个index序列是不同的8个碱基，这个和Nextera的i7（部分一样，请自己对照）是一样的。
i5 sequence: ATAC-seq的Adaptor1 里没有barcode

  1. N/S502 : CTCTCTAT
  2. N/S503 : TATCCTCT
  3. N/S505 : GTAAGGAG
  4. N/S506 : ACTGCATA
  5. N/S507 : AAGGAGTA
  6. N/S508 : CTAAGCCT
  7. N/S510 : CGTCTAAT
  8. N/S511 : TCTCTCCG
  9. N/S513 : TCGACTAG
  10. N/S515 : TTCTAGCT
  11. N/S516 : CCTAGAGT
  12. N/S517 : GCGTAAGA
  13. N/S518 : CTATTAAG
  14. N/S520 : AAGGCTAT
  15. N/S521 : GAGCCTTA
  16. N/S522 : TTATGCGA

i7 sequence:

  1. N701 : TCGCCTTA
  2. N702 : CTAGTACG
  3. N703 : TTCTGCCT
  4. N704 : GCTCAGGA
  5. N705 : AGGAGTCC
  6. N706 : CATGCCTA
  7. N707 : GTAGAGAG
  8. N710 : CAGCCTCG
  9. N711 : TGCCTCTT
  10. N712 : TCCTCTAC
  11. N714 : TCATGAGC
  12. N715 : CCTGAGAT
  13. N716 : TAGCGAGT
  14. N718 : GTAGCTCC
  15. N719 : TACTACGC
  16. N720 : AGGCTCCG
  17. N721 : GCAGCGTA
  18. N722 : CTGCGCAT
  19. N723 : GAGCGCTA
  20. N724 : CGCTCAGT
  21. N726 : GTCTTAGG
  22. N727 : ACTGATCG
  23. N728 : TAGCTGCA
  24. N729 : GACGTCGA

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图片发自简书App

1. 所以，ATAC-seq的这个Oligo designs （Adaptors）可以大概总结：

有两种Adaptors，分别为Adaptor1 （50bp） 和Adaptor2 （53bp）。
其中Adaptor1（5’ illumina Primer1 sequence （29bp）+ Tn5 Read1 sequence（14bp）（再延伸到ME里面7bp）3’），Adaptor2（5’ illumina Primer2 sequence（24bp）+ barcode sequence （8bp）+ Tn5 Read2 sequence （15bp）（再延伸到ME里面6bp）3’）
这样算来，ATAC-seq library的长度=左面（Adaptor1 长度 +剩余部分Tn5的ME（12 bp_TATAAGAGACAG））+ open chromatin 的DNA长度+右面（剩余部分Tn5的ME（13bp_GTATAAGAGACAG）+ Adaptor2 长度）=open chromatin 的DNA长度 + 128bp。
所以，在ATAC-seq的libraries中 mono nucleosome的ATAC-seq library长度大概是(单核小体146bp+核小体free region)+两端的adaptor及Tn5最里面部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=274bp+free region，也就是bioanalyzer里面看到的第二个peak。图中显示大概是340bp左右。所以free region应该是330bp-274bp=56bp 。
那么会问，对不对呢？看下bioanalyzer的第一个peak，显示是182bp，这个peak代表的是nucleosome free region的ATAC-seq library，所以是nucleosome free region序列长度 + 两端的adaptor及Tn5部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=182， 所以，不难得出同样的结果，nucleosome free region序列长度是54bp。差不多哦
以此类推，第三个peak代表de-nucleosome ， 500bp到550 bp之间，是不是等于两个核小体长度加上核小体空隙序列再加上两个adaptor， 2_146bp + 2_55bp + 128bp= 530bp （为什么55bp也要乘2？答：多出来一个核小体当然就多出来一份核小体空隙）

综上所述，ATAC-seq library长度比genome DNA实际长度一定多出128bp。

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nucleosome free region, mono-nucleosome, de-nucleosome and try-nucleosome

2. 下面一个问题，tagmentation时候，会出现gap？Nextera tagmentation on amplified cDNA (will create 9-bp gap）？

“GAP不是服装品牌，而是个坑”。
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所以需要在PCR第一步，需要5min的72摄氏度来填坑。还要注意，就是在tagmentation的时候会出现三种产物，上面的图只是其中一种。
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哪里说的不对欢迎纠正，请留言。