学习目标：

  • 学会用MACS2 call peaks
  • 理解MACS2 call peaks的结果

    Peak Calling

    Peak calling即利用计算的方法找出ChIP-seq或ATAC-seq中reads富集的基因组区域。
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    如下图所示，比对结果的文件中reads在正负链不均匀分布，但在结合位点聚集。正负链5‘末端的reads各形成一组合，通过统计学的方法评估这些组合的分布并和对照组比较，确定这些结合位点是否是显著的。
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    NOTE：ChIP-seq的分析方法可以鉴定两种类型的富集模式：broad domains和narrow peaks。broad domains，如组蛋白修饰在整个基因body区域的分布；narrow peak，如转录因子的结合。narrow peak相对于broad 或者分散的marks更易被检测到。也有一些混合的结合图谱，如PolII包括narrow和broad信号。

MACS2

peaks calling 有不同的方法，MACS2是最常用的call peaks工具。 MACS全称Model-based Analysis of ChIP-Seq，最初的设计是用来鉴定转录因子的结合位点，但是它也可以用于其他类型的富集方式测序。
MACS通过整合序列标签位置信息和方向信息提高结合位点的空间分辨率。MACS的工作流如下所示：
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MACS2的使用方法

了解相关参数：

输入文件参数：

  • -t:实验组，IP的数据文件
  • c: 对照组
  • f：指定输入文件的格式，默认是自动检测输入数据是什么格式，支持bam,sam,bed等
  • g:有效基因组大小，由于基因组序列的重复性，基因组实际可以mapping的大小小于原始的基因组。这个参数要根据实际物种计算基因组的有效大小。软件里也给出了几个默认的-g 值：hs – 2.7e9表示人类的基因组有效大小(UCSC human hg18 assembly).
    • hs: 2.7e9
    • mm: 1.87e9
    • ce: 9e7
    • dm: 1.2e8

输出文件参数：

  • —outdir:输出结果的存储路径
  • -n:输出文件名的前缀
  • -B/—bdg:输出bedgraph格式的文件，输出文件以NAME ’_treat_pileup.bdg’ for treatment data, NAME ’_control_lambda.bdg’ for local lambda values from control显示。

peak calling 参数

  • -q/—qvalue 和 -p/—pvalue
    q value默认值是0.05，与pvalue不能同时使用。
  • —broad
    peak有narrow peak和broad peak, 设置时可以call broad peak 的结果文件。
  • —broad-cutoff
    和pvalue、以及qvalue相似
  • —nolambda: 不要考虑在峰值候选区域的局部偏差/λ
    q值与峰宽有一定的联系。理想情况下，如果放宽阈值，您将简单地获得更多的peaks，但是使用MACS2放松阈值也会导致更宽的peaks。

Shift 模型参数：

  • —nomodel
    这个参数和extsize、shift是配套使用的，有这个参数才可以设置extsize和shift。
  • —extsize
    当设置了nomodel时，MACS会用—extsize这个参数从5’->3’方向扩展reads修复fragments。比如说你的转录因子结合范围200bp，就设置这个参数是200。
  • —shift
    当设置了–nomodel，MACS用这个参数从5’ 端移动剪切，然后用–extsize延伸，如果–shift是负值表示从3’端方向移动。建议ChIP-seq数据集这个值保持默认值为0，对于检测富集剪切位点如DNAsel数据集设置为EXTSIZE的一半。
    示例：
  1. 想找富集剪切位点，如DNAse-seq，所有5’端的序列reads应该从两个方向延伸，如果想设置移动的窗口是200bp，参数设置如下：
    —nomodel —shift -100 —extsize 200
  2. 对nucleosome-seq数据，用核小体大小的一半进行extsize,所以参数设置如下：
    —nomodel —shift 37 —extsize 73
  • —call-summits
    MACS利用此参数重新分析信号谱，解析每个peak中包含的subpeak。对相似的结合图谱，推荐使用此参数，当使用此参数时，输出的subpeak会有相同的peak边界，不同的绩点和peak summit poisitions.

ATAC-Seq call peaks示例

ATAC-seq关心的是在哪切断，断点才是peak的中心，所以使用shift模型，–shift -75或-100
对人细胞系ATAC-seq 数据call peak的参数设置如下：

  1. macs2 callpeak -t H1hesc.final.bam -n sample 
  2. --shift -100 --extsize 200 --nomodel -B --SPMR 
  3. -g hs --outdir Macs2_out 2> sample.macs2.log

MACS2输出文件解读

  • NAME_peaks.xls
    包含peak信息的tab分割的文件，前几行会显示callpeak时的命令。输出信息包含：
    • 染色体号
    • peak起始位点
    • peak结束位点
    • peak区域长度
    • peak的峰值位点（summit position）
    • peak 峰值的高度（pileup height at peak summit, -log10(pvalue) for the peak summit）
    • peak的富集倍数（相对于random Poisson distribution with local lambda）
      image.png
      Coordinates in XLS is 1-based which is different with BED format
      XLS里的坐标和bed格式的坐标还不一样，起始坐标需要减1才与narrowPeak的起始坐标一样。
  • NAME_peaks.narrowPeak
    *narrowPeak文件是BED6 4格式，可以上传到UCSC浏览。输出文件每列信息分别包含：
    • 1；染色体号
    • 2：peak起始位点
    • 3：结束位点
    • 4：peak name
    • 5：int(-10*log10qvalue)
    • 6 ：正负链
    • 7：fold change
    • 8：-log10pvalue
    • 9：-log10qvalue
    • 10：relative summit position to peak start（？）
      image.png
  • NAME_summits.bed
    BED格式的文件，包含peak的summits位置，第5列是-log10pvalue。如果想找motif，推荐使用此文件。Remove the beginning track line if you want to analyze it by other tools.???
    • .bdg
      bedGraph格式，可以导入UCSC或者转换为bigwig格式。两种bfg文件：treat_pileup, and control_lambda.
  • NAME_peaks.broadPeak
    BED6 3格式与narrowPeak类似，只是没有第10列。

summits.bed，narrowPeak，bdg, xls四种类型输出文件的比较：

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  • xls文件
    文件包含信息还是比较多的，和narrowPeak唯一不同的是peak的起始位置需要减1才是bed格式的文件，另外还包含fold_enrichment 和narrowPeak的fold change 对应，-log10pvalue,-log10qvalue,peak长度，peak 峰值位置等。
  • narrowPeak文件
    和xls文件信息类似
  • summits.bed文件
    包含峰的位置信息和-log10pvalue

  • bdg文件
    bdg文件适合导入UCSC或IGV进行谱图可视化，或者转换为bigwig格式再进行可视化。

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