3D基因组—实验技术

一、3D基因组之ChIP-seq

基因组的三维立体结构的主要组成是DNA和蛋白质。研究基因组的三维立体结构就是研究DNA与蛋白之间的互作。ChIP一直是研究蛋白与DNA互作的重要方法。他可以显示众多调节蛋白在基因组上的分布。

下表是生物体内常见的几种DNA调节蛋白。

Histone是核小体的基本组成蛋白，核小体是染色质的基本组成单位。组蛋白的修饰（如：甲基化，乙酰化，磷酸化等）使核小体在DNA上发生移动，改变核小体的位置。这使得特定的组蛋白修饰代表特定的生物学特征。例如H3K27ac代表激活型启动子区域，H3K27me3代表抑制型启动子区域，等等。

除了组蛋白外，还有一类重要的调控元件-转录因子来调节染色质的结构和功能，然而，转录因子要与RNA聚合酶II互作，才可以调控基因表达。

CTCF是一类重要的绝缘子蛋白，与RAD21蛋白形成稳定的3维立体结构区域，维持染色质的正常形态。

另外，您需要根据目的基因的表达情况选择相应的ChIP组合方式。

1.ChIP-seq数据分析

ChIP-seq的数据呈现形式是多种多样的。但主要以3种形式出现在文章中。
①最常见的peak图

②研究转录起始位点的TSS距离分布图，可以清楚的观察到TSS位点处，多种蛋白的分布情况。

③比较直观的热图，可以清楚的看出同一DNA区域，不同蛋白的分布情况，以及同一蛋白在不同DNA区域的分布情况。

二、3D基因组之Hi-C技术

Hi-C（High-throughput/resolutionchromosome conformation capture）技术，以整个细胞核为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。

1.Hi-C技术流程
Hi-C,Hi-C的基本流程是首先将染色质，用交联HindIII限制性核酸内切酶将DNA片段切开，形成粘性末端，将带有dCTP-biotion补齐粘性末端，用T4连接酶连接，纯化链接产物，用链霉亲和磁珠捕获带有biotion的DNA互作片段，测序比对DNA互作区域。

如何看懂Hi-C结果
如图所示，Hi-C主要有两种表现形式，一种是原始的方形图，一种是比较直观的三角图，其实，这两种图实际上是同一张图，先看方形图，横纵坐标都代表同一条染色体，对角线上的点像横纵坐标的投影，因此，对角线也表示染色体。内部马赛克点分别向横纵坐标及对角线延伸，延伸得到的焦点，为互作基因在染色体上的位置。马赛克点的颜色越深，代表基因互作强度越大。

Hi-C得出的数据是非常强大的。Hi-C的最小分辨率为5kb，在这个分辨率下，我们可以清楚的观察到基因的成环结构。这其中包括基因环，转录环，结构环以及增强子-启动子互作环。

当Hi-C分辨率到达10kb时，我们会发现多个相关连loop组成的拓扑相关结构域（TADs）。且TADs边界上一般都会有CTCF的富集。

当分辨率到达50kb时，我们可以看到由相关TADs组成的染色质区域。

当我们继续增大分辨率，我们将看到全部染色体的互作情况。

Hi-C数据强大我们已经看到，但想精确地模拟3D基因组的结构，还需要与ChIP-seq、RNA-seq、DNase-seq、FAIRE-seq等联合分析，才能精确构建3D模型。

三、3D模型验证技术

基因组模型构建完成后，我们需要对模型进行验证。主要从两个方面对模型进行验证，一个是模型结构进行验证，一个是对模型功能进行验证。

对模型的结构验证，我们也是从两个方面进行验证，一个利用DNA FISH对模型的空间定位进行研究，一个是利用3C对模型的空间结构进行验证。

对模型的功能验证，我们主要利用CRISPR技术去除模型结构，观察对应基因及细胞代谢的变化。

1.DNA FISH-模型空间定位验证
DNA FISH的基本流程与RNA及蛋白FISH相似，但DNA FISH探针要求更加严格，且细胞内的DNA及探针均需要变性。DNA FISH是观察细胞核中DNA分步，这需要更高放大倍数的共聚焦显微镜。

如下图所示，在母本染色体中，三个基因是分开的，在父本染色体中，3个基因经过环形折叠在一起。

2.3C-模型空间结构验证
3C的基本流程如下图所示。染色质先进行交联，交联后酶切，连接，再进行QPCR检测。3C技术主要捕获的是两基因间的互作，因此这种技术常用来验证基因间的互作。

下图所描述的是基因promoter区与增强子区的互作验证，我们可以看到FIP1L1与914kb处的增强子有互作。

3.CRISPR-模型功能验证
我们利用CRISPR 技术敲掉CTCF motif，使CTCF无法结合，基因组的3D结构模型被破坏，相应基因的表达受到影响，细胞功能也可能会受到影响。CRISPR的功能是强大的，您可以根据您的需要敲除增强子，沉默子，绝缘子，甚至基因。

CTCF位点被定点敲除

酶切检测敲除效率

PCR检测位点敲除后的基因变化

位点敲除后的功能检测

作者：Ray钱
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来源：简书
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