TBtools | 地球最友好的 GFF3/GTF 序列提取工具

无论是Windows，MacOS, Linux桌面的用户，你都可以也会使用。

写在前面

伴随基因组测序的普及，越来越多物种的基因组测序项目开展并报道，为科研工作者提供了更为全面的参考序列信息。目前，单纯植物类已公布的基因组，应在400~500个物种之间。这带来了更多的数据，也带来了更多的信息分析挑战。物种基因组公布，往往(至少)会公布两个文件：

1. 物种基因组序列文件，如 genome.fa
2. 物种序列特征注释文件【或更常见的 基因结构注释信息文件】，如 genome.gff3 / genome.gtf

对于具有编程基础或熟悉 Linux 操作系统的数据分析人员，往往可以通过编写脚本或使用诸如 gffreads 等命令行工具来进行序列提取【如：所有基因的 CDS 序列】。但对于可以从数据中受益的更多人而言，这并不是一个完美选项。

三年前，TBtools 释放了 GTF/GFF3 Sequences Extract 功能，应为极少见的【至少我没见过其他】 可实现基于 GTF/GFF3 注释信息 从全基因组序列中提取 指定特征序列集合 的GUI工具。

【注，其中 Start 摁钮为灰色，即不可用，下文有说明】

常见用途

1. 提取所有 CDS 序列集合（可用 TBtools 直接翻译成 蛋白序列集合）
2. 提取所有 Exon 序列集合（即注释文件中所有转录本序列）
3. 提取所有 Gene 序列结合（即基因的所有Exon和Intron序列）
4. 提取所有 Promoter 序列集合（或为 UTR及上游1~2kb；或为 ATG及上游1~2kb等）

TBtools 提取出的序列可以保证 ID 完全统一，方便后续任何分析【如基因结构可视化，基因定位在染色体上等等】。当然，TBtools 也提供了 GTF/GFF3 信息整理工具，可方便用于直接整理 ID 重命名的映射文件，随后可用 Fasta Rename 直接进行批量重命名。

以下，大体介绍下两个常见用途（提取 CDS 或 提取 Promoter）的操作姿势

使用到的文件

【注：如果文件是.gz .rar .tar.gz 等后缀的压缩文件，请先解压缩再使用】

使用第一步

GFF3/GTF文件中存储的序列特征很多，对于 GUI 操作，用户往往需要全面了解文件中可供提取的序列特征，如CDS, Exon等。所以使用这一功能的第一步，即 a) 导入GFF3/GTF文件 b) 点击初始化

可以看到，点击初始化之后，Feature ID等均有了变化

同时还会弹出一个文本对话框，这个对话框，事实上用户辅助用户选择 Feature Tag 和 Feature ID。

1. Feature Tag，一般是 CDS, Exon, mRNA, Transcript, Gene等，用户往往已经知道自己要提取什么，不需要辅助
2. Feature ID，以 CDS 和mRNA为例。我们很清楚，真核生物中，大多数基因均是断裂基因，即 Exon-Intron-Exon… CDS即Exon的部分，所以CDS本身在基因序列的尺度上，也是被 Intron 所分隔。当我们需要提取 CDS 的时候，往往我们说的并不是提取 一截CDS，而是把某个转录本对应的几截甚至几十截 CDS 按照正确的顺序和方向连接起来之后的真实的 CDS 全长。于是 ，如何连接，这个时候，就需要用户指定一个 ID，如下，

可以看到 GFF3 注释文件中，同一个转录本 ATG01010.1 拥有几截CDS。这些 CDS 可以以 Parent 这个 Feature ID 来归组，并组合成 ATG01010.1 的 CDS 全长。事实上，这个文件比较简单，因为 CDS 并没有更多的 Feature ID 可以选择。在其他物种中，常常会出现各种各种的 Feature ID，比如直接是 ID=。
可以看到图片中还有 mRNA，在这个注释文件中，每一个mRNA基友 ID= 也有 Parent=，前者事实上是这个 mRNA 独有的标签，后者则记录了这个 mRNA 属于是哪一个基因的转录本之一。此时，如果是要提取这个mRNA的序列【包括Exon和Intron】，那么设置 Feature ID 为 ID 则是正确的。如果选择 Feature ID 为 Parent，则只会得到不理想的结果。一个基因多个转录本会有完全相同的 Parent 便签，这些转录本会按顺序串联起来，这并不没有生物学意义。

于是，可以开始不同的提取操作了，但是在开始之前，还有一件事情一定不能忘记。

注意事项

TBtools 所有 GUI 功能的设计与使用遵从一个基本逻辑：set [I]nput files，set [O]utput files if needed，click [S]tart button，简称 IOS。

所以，下述任何操作，即点击 Start 之前，先设置输出文件。

提取物种所有 CDS 序列

【注意，必须先设置 输出文件】

很快，可以看到输出文件。其中包括了物种【注释文件中包括】的所有CDS序列全长。

如果需要 蛋白序列 集合，那么只需要直接用 TBtools 的 批量翻译功能即可。

提取所有转录本的 Promoter 序列

Promoter 往往指 UTR上游1~2kb 的区间，这并不绝对，因为顺式作用元件同样可以存在于 Intron 甚至是 Exon 上。目前，大多数物种的基因结构注释信息并不完善，在常见的数据分析中，除少数模式生物，如拟南芥，水稻，人类等，在提及对 Promoter 序列的分析，往往直接使用 翻译起始密码子ATG上游1~2kb的序列。此处，也以同样的方式处理【注，这并不是我本人的生物学认定，仅为演示用】。

于是可以得到，

于是，在所有 CDS 全长的前面，增加了 1000bp 的序列，即上述提及的 Promoter 序列。

很多时候，大家需要的是不包含CDS序列的，纯粹的 Promoter 序列，这个时候，只需要勾选多一个选项即可，

于是得到

于是，对于其他序列特征，如Exon全长，miRNA前体等等，参考以上就可以了。

其他参数详解

这个功能基本完善于两三年前，但是参数还是比较丰富。

其中：

1. 仅提取不多于指定Feature数目的序列，比如，有时候我们只需要 单外显子 转录本的，那么这个时候，指定最多允许1个Exon即可。
2. 仅提取不少于指定Feature数据的序列，与1. 正好相反
3. 保留注释信息在输出的 Fasta 文件 ID，中，有时候我们希望得到信息相对全面的文件
4. 提取 Feature 5’ 端上游指定长度的序列，如上述的 CDS 上游1kb
5. 提取 Feature 3’ 端下游指定长度的序列
6. 只保留上游或下游序列

补充

当然，你可能还有各式各样的需求。
你只是需要部分基因的Promoter，那就用 TBtools 的 Fasta Extract，

你想要提取GFF3中每个转录本对应的基因ID，

你又想要批量对提取之后的序列进行重命名

你还要想什么？用好搜索框！不用拼命翻菜单。

写在后面

昨天半夜醒来，毫无困意。推文写得七七八八，加上前述也听闻 follower 要在他们的软件里面实现类似的功能，那么索性推出，方便作为他们的参考。整体上，这个功能自从推出后，几乎没有更新过。不过我个人的使用频次较高，主要原因在于，越多物种的基因组数据要分析，越多项目需要开展，那么 ID 的一致和统一就越显得重要，而 TBtools 在这块上从设计之初就很在意。
有时候，我们更多地应该从程序解析或者机械自动化的角度去思考问题，设计和实现功能；而不是纯粹考虑输出结果如何迎合人类偏好。因为，人的欲望是复杂的，甚至是无规律可循。于是，剩下的，就只有断层。
当然，这也是为什么，很多类似生信小工具很少人愿意去写，比如 TBtools 的 Fasta 序列操作（包括提取，重命名，格式化等等）。为什么在 TBtools 之前没有轻便的工具【事实上，除去JRE和一些Wrapper程序，TBtools的整体大小只有几Mb】?
其实道理就这么简单，因为简单而且繁杂的事情，做数据分析/软件开发方向的绝大多数人，并不在意或者并不愿意，因为这看起来并没什么技术含量，就跟我现在一直在做的多数工作一样。
不过，有没有技术含量，跟值不值得，喜不喜欢，似乎并没有关系。市面上，又有多少是有技术含量的呢？如果你认真起来。