补偿对照荧光素的光谱应与实验抗体的一致
更准确地说，补偿对照和实验抗体的荧光素应完全相同，而不仅仅是相似。 例如，即使AlexaFluor®R488和FITC在光谱上非常相似，AlexaFluor®R488补偿对照也不能用于FITC的补偿调节，反之亦然。 其他的例如APC和AlexaFluor®R647不能相互代替，APC-Cy7和APC-H7不能相互代替。
对于串联试剂（例如PE-Cy7、APC-Cy7），不同批次之间存在很大的光谱差异，这可能会导致SOV的差异，因此，建议用户每个批次都要跑一下单染做补偿。
阳性群和阴性群的自发荧光必须相等
溢出值（SOV，Spillover Value）计算时，是假定溢出检测器的平均荧光强度中的任何差异只由荧光染料不同引起。 如果自发荧光不同，则溢出检测器中MdFI（平均荧光强度）的一部分将由自发荧光的差异引起，而不是单纯荧光染料本身。
下表就是一个典型的例子，在使用相似自发荧光的阳性和阴性细胞测量FITC漏到PE的SOV时，计算出的SOV为27％。 但是，阴性群体如果错误地使用了微球，就会导致SOV为22％，两者之间的SOV相差5％。
同样的，细胞类型也需要尽量一致，例如细胞系和原代淋巴细胞就不能作为相互的对照，再如计算淋巴细胞某标记的SOV时，就不能用单核细胞来作为阳性或阴性对照。
此处有一个常见的误解：SOV取决于您所分析的细胞类型和自发荧光。
这是错的。 SOV仅取决于荧光染料本身的特性。 正确测量后，SOV与生物学样品中的细胞类型无关。上面所说的只是要求阳性和阴性细胞群均要采用同一种细胞，从而保证SOV的正确性，无论用什么细胞，最后的SOV值都是一样的。
阳性群体应尽可能强
如下图所示，SOV等于两个检测器的MdFI的斜率（虚线，Slope），所以说，SOV并不会随着强度增强而增大，而是在整个动态范围内都是相同的。 正确的SOV可以提供正确的补偿，无论应用的群体是强表达的还是弱表达的。
之所以平时让大家尽量强的阳性群体，是因为当计算斜率时，阳性和阴性两个数据点离的远，可获得更准确的测量值（即SOV）。 这对于低溢出值（例如PE-Cy7到PE）尤其重要。
但是，我们很少能获得“完美”的SOV，如上图所示，随着主检测器MdFI的增加，SOV中任何误差的影响都会放大。在此例中，如果补偿误差不足1％， SOV将对弱表达群体影响很小，比如当FL1中的MdFI为10E3时，FL2中误差就达到了10 MdFI，忽略不计；但是，如果FL1的MdFI为10E5，则FL2的MdFI误差为1000，有时候可能会被误认为PE阳性群体。
收集足够的事件以获得有意义的准确SOV
根据经验，阴性和阳性群体至少要收集5000个事件，这是为了确保测量的准确性，尤其是对于低SOV的荧光素抗体。
参考文献：Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019;49(10):1457–1973. doi:10.1002/eji.201970107
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