什么叫VBNC？

活的但不可培养的状态（Viable but nonculturable, VBNC）细菌是指处于代谢活性非常低的状态并且不分裂、但一旦被复苏就具有存活能力并且能够变得可培养的细菌。VBNC状态是1982年首次发现的，这是一种独特的状态，在这种状态下，许多细菌会对不利的环境做出反应。

进入VBNC状态后，传统的平板计数技术无法检测到食源性致病菌。据报道，在食品加工和保藏过程中的极限环境条件，如极端温度、干燥、辐照、脉冲电场和高压应力，以及添加防腐剂和消毒剂，都可以诱导许多食源性病原菌进入VBNC状态，将给食品安全和公共卫生带来严重的危机。

研究表明，许多病原体和非病原体都可以进入VBNC状态，例如嗜水气单胞菌、根癌农杆菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、空肠弯曲菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌(包括肠出血性大肠杆菌)、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜肺军团菌、单核细胞增生性李斯特菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌等。

许多人认为，处于VBNC状态的病原体尽管保留了它们的毒力特性，但不能诱导感染/疾病。然而，不少研究已经表明，当VBNC病原体到达宿主后，复苏和新陈代谢活动的恢复会导致感染和疾病。例如VBNC O1霍乱弧菌在兔回肠循环试验(RICA)和人类志愿者实验中均呈现了明显的毒性。可见，VBNC状态的病原体，或与相当多无法培养出病原体的感染和疾病呈密切相关。

VBNC的传统检测技术

  1. 萘啶酸处理后，用明场显微镜观察
    萘啶酸（20–40 mg/L）可使细胞停止分裂。 暴露于萘啶酸后，活细胞继续生长，形态延长，而无代谢活性的细胞将保持其原始形状和大小，此时，在显微镜下观察细胞，就会发现活细胞的形态拉长，而VBNC/休眠细胞则偏椭圆形。
  2. 荧光显微镜
    各种荧光染色方法可用于确定VBNC状态。 常用的染色剂有吖啶橙、4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、异硫氰酸荧光素（FITC）、吲哚-硝基苯基-苯基氯化四氮唑（INT）和5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四氮唑（ CTC）。 下表总结了这些染料的作用方式和观察到的反应。
    | 染料 | 机制 | 反应 | | —- | —- | —- | | 吖啶橙 | 染色反应取决于细胞中DNA与蛋白质的比例 | 活跃繁殖的细胞呈绿色，但染色时生长缓慢或非繁殖的细胞呈橙色 | | 二氨基苯基吲哚（DAPI） | 差异染色 | 活细胞在荧光显微镜下呈绿色 | | 吲哚-硝基苯基-苯基氯化四氮唑（INT） | INT与脱氢酶反应生成甲瓒呈红色 | 活细胞呈现红色 | | 异硫氰酸荧光素（FITC） | 活细胞中的酶活性 | FITC将活细胞染成紫色或蓝色 |

近年来，还出现了一种新的差异染色测定法，即BacLight活/死测定法。 通过使用两种核酸染色剂，即绿色荧光的SYTO 9染色剂和红色荧光的碘化丙啶染色剂，该测定法可以同时计数总细胞和存活（代谢活性）细胞。 SYTO 9可以染色活细菌和死细菌，而碘化丙啶只能穿透膜受损的细菌。 当一起使用时，碘化丙啶可降低膜受损的死细菌的SYTO 9荧光，导致死细菌呈红色，而活细菌则发出绿色荧光。

  1. 分子技术
    杂交探针是经过化学或放射性标记的核酸（DNA/RNA），可用于检测互补靶标DNA/RNA。
    只要使用适当的独特引物，即可从环境和临床样品的DNA提取物中特异性扩增DNA靶标，无需进行培养即可检测特定生物或相关生物组，但检测DNA不能区分目标生物体的可培养形式和不可培养形式。
    而逆转录酶PCR（RT-PCR）可以区分活细胞和死细胞，原理基于mRNA（mRNA寿命短，半衰期少于1分钟）。mRNA仅存在于具有代谢活性的细胞中，而在细胞死亡后便不存在。
    也可使用不同类型的印迹（例如菌落印迹、缝隙印迹、斑点印迹和Southern印迹）直接从环境样品中检测VBNC细胞。印迹的原理是使用放射性或非放射性或荧光标记探针。
    荧光原位杂交（FISH）是杂交探针的另一种形式，其中荧光标记的DNA或RNA探针与靶标核酸在整个透化细胞中杂交。通过将rRNA靶向的探针与落射荧光显微镜结合使用，该方法可用于检测单个微生物细胞。这是通过选择性靶向rRNA的区域来完成的，通过选择适当的rRNA探针序列，FISH可用于检测VBNC的所有细菌细胞（通用探针）或单个细胞群（菌株特异性探针）。但灵敏度较低，无法区分活细胞和死细胞。

成像流式给VBNC检测带来了什么革命性突破？

2015年，Morishige等人建立了一种简便、快速的VBNC沙门氏菌代谢活性的方法，测量了3种不同的代谢活性：5-氰基-2，3-二苯基四唑氯(CTC)还原测定的呼吸活性，2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxyglucose(2-NBDG)测定的葡萄糖摄取活性，以及5-乙炔基-2‘-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)掺入测定的DNA合成活性。在此研究中，Morishige同时用了共聚焦激光扫描显微镜和常规流式细胞仪。两个平台的结合，对实验结果是较好的完善和补充，但也给实验结果的汇总统计带来一定的困难。

如果有了成像流式细胞仪，那么就会变得不同了，图像和功能指标就能得到很好的统一，真正做到「一次处理，多类指标」，不仅克服了VBNC的检测难题，从多方面给出客观数据，而且极好的体现了流式技术的快速优势。

光说不练假把式。

2019年，Dey R等人利用成像流式细胞仪ImageStream MkII分析了条件致病菌「铜绿假单胞菌」及其与自由生活的多食阿米巴相互作用的报告。铜绿假单胞菌能够对各种环境条件(包括饮用水管道中存在的物质)做出反应，进入VBNC状态，从而防止抗生素等杀菌剂对其的杀伤作用。对于许多重要的人类病原体，包括但不限于铜绿假单胞菌，VBNC细菌的准确检测和定量一直非常困难。该研究中，作者发现，转染了GFP的铜绿假单胞菌，GFP荧光强度在进入VBNC状态后5个月仍保持稳定，使用成像流式，根据形态和大小很轻松区分VBNC状态和活性状态（VBNC细菌呈典型的圆形，而活性细菌呈细长/杆状）。在下图中，滋养体内共培养的VBNC细胞能够恢复到可培养状态（活性状态），与阿米巴共培养2小时后，活性铜绿假单胞菌的数量增加了3个log(A图）；没有阿米巴的这组也出现类似的结果，不过速度很慢（B图）。除了常规信号，A、B两个图下方由成像流式细胞仪同步采集的图像，更好的显示了R2门内的VBNC状态和非R2门内的活性状态：
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2020年，Chen S等人使用配备有氩激光（488nm，15mW）的成像流式细胞仪FlowSight进行活细菌和VBNC细菌的计数，同样采用了Morishige等人使用的CTC染料，因为该染料在细菌呼吸过程中，很容易还原为不溶于水、发红色荧光的甲瓒。 步骤也很简单，将2毫升CTC溶液添加到198 ul大肠杆菌悬浮液中，以使最终CTC浓度达到2 mM，然后在37°C的黑暗环境中孵育4小时即可上机。就这样，作者不仅发现了大肠杆菌在不同浓度氯气或氯胺作用下容易进入VBNC状态，并且利用成像流式对不同状态的大肠杆菌动态变化进行监测，描述了可培养大肠杆菌诱导进入VBNC状态的动力学过程，给出了预测VBNC大肠杆菌数量的数学模型，模型的预测结果与可培养细胞、活细胞、死亡细胞和VBNC细胞数的实测值吻合较好，因此较好的解决了目前饮用水管理系统研究的一个主要焦点。

由这两篇典型的代表文献可见，在VBNC细菌的鉴别上，成像流式能够从细菌形态、荧光染料等多指标上同时分析，并且节省大量的时间，从而较其它实验手段有着极大的优势，值得食品安全和公共卫生相关专业的FLOWER在研究中采用。

参考文献

  1. Xu, H. S., Roberts, N., Singleton, F. L., Attwell, R. W., Grimes, D. J., and Colwell, R. R. (1982). Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microb. Ecol. 8, 313–323. doi: 10.1007/BF02010671
  2. Md. Fakruddin, Khanjada Shahnewaj Bin Mannan, Stewart Andrews, “Viable but Nonculturable Bacteria: Food Safety and Public Health Perspective”, International Scholarly Research Notices, vol. 2013, Article ID 703813, 6 pages, 2013. https://doi.org/10.1155/2013/703813
  3. Morishige Y, Fujimori K, Amano F. Use of Flow Cytometry for Quantitative Analysis of Metabolism of Viable but Non-culturable (VBNC) Salmonella. Biol Pharm Bull. 2015;38:1255-64.
  4. Dey R, Rieger AM, Stephens C, Ashbolt NJ. Interactions of Pseudomonas aeruginosa with Acanthamoeba polyphaga Observed by Imaging Flow Cytometry. Cytometry A. 2019 May;95(5):555-564. doi: 10.1002/cyto.a.23768.
  5. Chen S, Zeng J, Wang Y, Ye C, Zhu S, Feng L, Zhang S, Yu X. Modelling the effect of chlorination/chloramination on induction of viable but non-culturable (VBNC) Escherichia coli. Environ Technol. 2020 Nov;41(26):3443-3455. doi: 10.1080/09593330.2019.1611939.