人类红细胞（huRBCs）是人体中最常见的细胞类型之一，在整个人类进化过程中都处于严格的遗传选择之下，红细胞引起的疾病给许多人口和医疗保健系统带来沉重负担。由于红细胞生成存在物种特异性差异，所以需要人类红细胞生成的体内模型，但现在还没有有效的人源化免疫缺陷小鼠模型（即外周血中能持续存在成熟的huRBC、能有效观察到人类红细胞生成功能过程和RBC完整性）。对镰状细胞病（SCD）等红细胞疾病的综合分析，需要循环中成熟的RBC用于疾病建模和治疗方法的测试。
肝脏人源化可拯救循环中的人类红细胞
MISTRG小鼠在Rag2−/−IL2RG−/−(RG)背景下携带人类细胞因子粒-单核细胞和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-3(I)、血小板生成素(T)和信号调节蛋白α(S)的敲入，信号调节蛋白α是“不要吃我”信号调节蛋白CD47的受体。
将胎肝(FL)CD34+细胞植入MISTRG小鼠830%)和骨髓(~50%)中的植入率较高。
红系细胞(huCD235a+)在骨髓中的植入率不高(~5%)，而在外周血中不存在huRBCs，表明循环中的HuRBC被破坏，如前所述。
为了确定HuRBC破坏的动力学和位点，我们将荧光标记的人和鼠(Mu)红细胞注射到MISTRG小鼠，并确认快速优先清除循环中的HURBCs。
输注标记的huRBCs而不是muRBC在肝脏和脾脏蓄积，在输注后60min达到峰值，提示小鼠吞噬细胞的隔离和破坏。
先前的研究表明，小鼠宿主中的HuRBC被覆有小鼠补体3(MuC3)，它可能以小鼠巨噬细胞和其他吞噬细胞为靶标。
注入MISTRG小鼠的huRBC而不是muRBC被迅速包被muC3(图1C)。
从肝脏分离的HuRBCs与小鼠巨噬细胞标记物F4/80+(图1D)共染色，表明小鼠肝吞噬细胞对HuRBCs有隔离作用。
我们在注射荧光标记的人或鼠红细胞立即对肝脏进行活体成像，同时以右旋糖酐确定血管位置。
我们观察到HuRBC，而不是muRBC，迅速并持续地被困在肝脏血管系统中。因此，小鼠肝脏是hRBC隔离和破坏的主要部位之一。
肝脏产生许多天然免疫防御所必需的蛋白质，包括补体，并含有大量的组织巨噬细胞。
我们用CRISPR-CAS9在MISTRG中删除了延胡索酰乙酰乙酸酯水解酶(Fah)基因，建立了MISTRGFah−/−(MISTRGFah)小鼠，并用蛋白免疫印迹法证实了Fah基因的缺失。
我们成功地人源化了MISTRGFah小鼠的肝脏，通过脾内注射成人人肝细胞和饮用水中逐渐去除2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）-1,3-环己二酮(NTBC)，导致Fah−/−小鼠肝细胞死亡和人肝细胞再生。以移植小鼠肝细胞(MuHep)的MISTRGFah小鼠(MuHepMISTRGFah)为对照。
人血清白蛋白(HuALB)浓度在人肝移植后8周左右达到高峰。人血清白蛋白作为确认人肝细胞再生的验证指标，其水平高于4mg/ml表明80%-95%的肝细胞为人肝细胞。
为了确定肝脏人源化对huRBC存活的影响，我们重复输注荧光标记的红细胞，并将huHepMISTRGFah和muHepMISTRGFah与MISTRGFah小鼠进行比较。
HuHepMISTRGFah组小鼠外周血中HuRBC的存活时间明显长于MISTRGFah和muHepMISTRGFah组小鼠，且HuRBC的存活期>72小时。
HuHepMISTRGFah小鼠外周血中只有一小部分huRBCs被muC3包被，而muHepMISTRGFah小鼠中huRBCs的muC3阳性率很高(图1F)。
从huHepMISTRGFah小鼠的肝脏中分离出的输注的huRBC不再与小鼠的F4/80+共染色，这表明hRBC对肝脏中的小鼠吞噬细胞的靶向减少。
此外，人肝中F4/80+巨噬细胞的总数比人肝中的显著减少(图1，G和H)，因此，肝人化延长了融合的人红细胞的存活率，降低了人C3的浓度，降低了小鼠肝脏中的吞噬细胞数，使人的红细胞表面包裹了人的C3，并随后破坏了人的红细胞(HuRBC)。(2)肝人性化延长了融合的人红细胞的存活率，降低了鼠的吞噬细胞数，使人的红细胞表面包裹了人的C3，并对其随后的破坏起到了促进作用(图1，G和H)，从而延长了融合的人红细胞的存活率，降低了鼠的C3浓度。
HuRBC在移植HuHepMISTRGFah小鼠体内的循环
为了确定肝脏人源化是否会减少小鼠体内产生的HuRBC，我们测量了植入人造血干细胞和祖细胞(HSPC)的、肝脏重组的huHepMISTRGFah和muHepMISTRGFah小鼠循环中的HuRBC。
在6、8和10周时，huHepMISTRGFah小鼠外周血中显示出较高的人类白细胞(huCD45+)。
此外，huHepMISTRGFah小鼠在植入后4周和至少12周都表现出持续循环的HuRBC(huCD235a+)，占外周血中RBC总数的12%。
在小鼠HepMISTRGFah中，HuRBC仍然缺失(<总RBC的0.1%)(图2，A和B)。
对huRBC的定性分析显示，随着huCD71−huCD235+(图2，C和D)和huCD49d−Band3+(图2，E和F)的表型转变，huMISTRGFah小鼠的循环huRBCs(图2，G和H)几乎完全去核，成熟度提高。
无论是huHepMISTRGFah小鼠还是muHepMISTRGFah小鼠，都没有携带表面muC3阳性的循环HuRBC，这与先天免疫系统对C3包裹的RBC的快速清除是一致的。
HuHepMISTRGFah小鼠缺乏muC3包被，HuRBC存活，提示肝脏人源化抑制了muC3的表达。
事实上，huHepMISTRGFah小鼠血浆中muC3蛋白浓度显著降低。
缺少muC3表达和获得的huC3表达在HuHepMISTRGFah小鼠体内通过肝脏人源化证实了所提出的机制。
肝巨噬细胞由驻留在肝脏的枯否细胞和骨髓来源的募集巨噬细胞组成(14)。
我们评估了肝脏人源化是否会通过优先招募人类HSPC来源的巨噬细胞来改变肝巨噬细胞的组成。
事实上，在huHepMISTRGFah小鼠中，人肝细胞的肝再生导致小鼠F4/80+巨噬细胞被人CD68+巨噬细胞取代，而muHepMISTRGFah小鼠除了人巨噬细胞外，仍然含有大量的小鼠巨噬细胞。
因此，在huHepMISTRGFah小鼠中，hRBC免于破坏，至少部分是因为消除了补体介导的调理作用，并被小鼠的先天免疫系统识别。
肝脏人源化促进人类红细胞生成
肝脏人源化延长了循环人红细胞存活时间。
为了确定肝脏人源化是否也影响HuRBC的生成，我们分析了骨髓内的人红细胞生成。
总体而言，huHepMISTRGFah小鼠的huCD45+植入率高于muHepMISTRGFah小鼠BM(图2)。
S4、A到C)，但髓系(huCD33+)、B淋巴系(huCD19+)和T淋巴系(huCD3+)的分布无显著差异。
增强的嫁接水平在所有祖代亚群中都得到了转化。
人红系植入(huCD235a+)在huHepMISTRGFah BM(图3，A到C)和脾脏(图3)中显著较高，逐步下调huCD71，获得huCD235a表达(图3，D和E)，下调huCD49d，获得Band3。
因此，HuHepMISTRGFah中的肝脏人源化促进了人红系的植入和成熟。
我们假设，huHepMISTRGFah小鼠中muC3表达的降低也将使骨髓中的人类红系祖细胞和红细胞得以幸免。
事实上，在huHepMISTRGFah小鼠中，muC3染色非常低，而在muHepMISTRGFah的骨髓中，几乎100%的人红系祖细胞被muC3覆盖。
在成熟红细胞从骨髓中排出之前，其浓缩的细胞核被所谓的骨髓红系造血岛(EBI)内的巨噬细胞移除，EBI由中央巨噬细胞组成，周围环绕着不同成熟阶段的红系前体细胞(16，17)。
人M-CSF在MISTRG小鼠中的表达是单核细胞向组织巨噬细胞充分成熟所必需的(7，18)。
我们用多光谱成像流式细胞术评估了HuHepMISTRGFah小鼠骨髓中EBIs的形成。
图3肝脏人源化增强人类红细胞生成。
(A和B)人红系祖细胞在muHepMISTRGFah(n=8)和huHepMISTRGFah(n=13)小鼠骨髓中的代表性流式细胞仪图谱(A)和定量(B)。
(C)muHepMISTRGFah(n=8)和huHepMISTRGFah(n=13)小鼠huCD235染色的典型骨髓组织学图像。 比例尺，100 mm；原始放大倍数，10倍。
(D和E)基于huCD71和huCD235在muHepMISTRGFah(n=8)和huHepMISTRGFah(n=13)小鼠骨髓中的表达测定红系分化的代表性流式细胞仪图谱(D)和定量(E)。
(F)成像流式细胞术在HuHepMISTRGFah小鼠中的人EBIs的设门策略。
BF，亮场。
(G)人EBI的代表性图像。白色箭头指向的是与中央巨噬细胞接触的去核网织红细胞。比例尺，10 mm；原始放大倍数，40倍。
EBI包含许多全人EBI，其特征是huCD169+huCD14+双阳性中央巨噬细胞，周围环绕着不同大小的huCD235a+红系祖细胞，包括去核的huRBC(图3F)。
Hoechst染色的去核定量表明，在muHepMISTRGFah和huHepMISTRGFah小鼠的骨髓中，去核的人红细胞的比例相等(图3)。
S5、H和I)。
因此，肝脏人源化增加了红系整体的植入和成熟，但不影响终末去核。
然而，在huHepMISTRGFah小鼠体内，由于缺乏muC3的表达和小鼠肝脏吞噬细胞的减少，退出骨髓的去核huRBC受到保护而免受破坏。
HuHepMISTRGFah小鼠SCD模型的建立
SCD中珠蛋白b链的单核苷酸突变导致血红蛋白在低氧压下聚合，从而导致红细胞膜的进行性损伤。
血管闭塞和组织缺氧随之而来的是镰刀状红细胞在毛细血管后静脉中的粘附，以及内皮激活和白细胞粘附等附加因素增强的致密镰状红细胞的选择性捕获(20，21)。
为了确定增强的红细胞生成，尤其是循环中的HuRBCs是否足以在huHepMISTRGFah小鼠中复制SCD，我们将成年SCD患者和年龄匹配的对照组的HSPC移植到huHepMISTRGFah小鼠中。
总体而言，huCD45+在骨髓中的植入、谱系分布和红系植入在植入正常和SCD HSPC的小鼠之间相似。
正常和SCD HSPC移植的小鼠都出现了如前所述的轻度贫血。
图4.HuHepMISTRGFah小鼠镰状细胞疾病模型。
(A和B)成熟去核HuRBC(huCD235a+，Hoechst−)和mRBC(muTer119+，Hoechst−)在SCD(A)和正常(B)BM CD34+细胞移植的HuHepMISTRGFah小鼠(n=3)外周血中的代表性成像流式细胞术图像。
(C和D)人EBIs在SCD(C)和正常(D)BM CD34+细胞移植的huHepMISTRGFah小鼠骨髓中的代表性图像(每个骨髓6个)。
(E-H)SCD(n=6)和正常(n=6)BM CD34+细胞移植的HuHepMISTRGFah小鼠的人特异性抗血红蛋白α(HBA)抗体染色的代表性组织学图像。
比例尺，100 mm；原始放大倍数，20倍。
(E)箭头标记肺泡出血和血栓形成；(F)箭头标记红系前体细胞扩张、肝窦内镰状红细胞、血管闭塞和脾血栓形成；(G)箭头标记肝窦内镰状红细胞和肝内微血管血栓形成；(H)箭头标记移植SCD的huHepMISTRGFah小鼠肾毛细血管和管周毛细血管充血及充血的肾小球；(G)箭头标记移植SCD的HuHepMISTRGFah小鼠肾毛细血管和管周毛细血管充血及充血的肾小球；(G)箭头标记肝窦内的镰状红细胞和微血管血栓形成；(H)箭头标记移植SCD的HuHepMISTRGFah小鼠肾脏毛细血管和肾小球充血。
这些数据代表了两个独立的实验，分别使用正常和SCD CD34+细胞的两个不同的捐赠者。
我们在SCD HSPC移植小鼠的外周血中观察到镰状HuRBCs(每100个HuRBC中有7到11个镰状HuRBCs)(图4A)，但在正常HSPC移植小鼠(图4B)中没有观察到。
SCD(图4C)和正常(图4D)HSPC移植小鼠在其各自的骨髓中均显示EBI。
为了确定循环中的镰刀形人红细胞是否会导致血管闭塞及其相关发现，我们比较了正常和SCD HSPC移植小鼠的肺、肝、脾和肾的组织学切片。
移植SCD HSPC的小鼠的组织显示出显著的异常，这与人血红细胞引起的SCD血管闭塞相一致，这在正常的HSPC移植的小鼠中是不存在的。
肺泡巨噬细胞增多与肺泡出血和血栓形成相关。
脾脏显示红系前体扩张，血窦内有镰状红细胞，血管闭塞和血栓形成。
干细胞移植小鼠的肝脏结构被破坏，出现血窦和微血管血栓中的红细胞。
肾内毛细血管环和管周毛细血管充血，肾小球充血，充满镰状红细胞，而对正常HSPC移植小鼠无明显影响。
因此，该模型允许成功植入成人HSPC，并建立正常和SCD患者的强健的红细胞生成。
此外，来自镰刀细胞捐献者的循环中的人红细胞复制了SCD的特征，即小鼠体内造血和非造血器官的血管闭塞。
讨论
免疫缺陷小鼠模型历来是人类红细胞生成的不良宿主。
尽管最近人类细胞因子敲入(6，7)或小鼠宿主干细胞因子受体(4，5)突变改善了骨髓生态位，但外周血中的HuRBCs普遍缺失。
通过脂质体氯膦酸钠清除吞噬细胞导致人红细胞的短暂循环，证实了先天免疫系统的参与(4，5，22)。
氯膦酸钠脂质体毒性大，死亡率高，由于吞噬细胞在1到2周内再生，只能提供暂时的益处。
最近的一项研究表明，muC3介导huRBC与小鼠吞噬细胞的粘附，然而在体内耗尽muC3只在吞噬细胞被克罗膦酸盐治疗的同时消除时才能提高huRBC的存活率[9]。
在我们的研究中，我们确定小鼠的肝脏是hRBC隔离的主要部位。
在人HSPC移植的huHepMISTRGFah小鼠中，肝脏人源化显著减少muC3的合成，并导致再生肝中小鼠巨噬细胞密度的降低。
因此，肝脏人源化可能通过消除muC3和减少肝脏Kupffer细胞，导致循环中持续的去核、成熟的HuRBC。
植入人类HSPC的huHepMISTRGFah小鼠表现出增强的人类红细胞生成。
与所有其他人源化免疫缺陷小鼠模型不同，MISTRG小鼠表达人M-CSF，它允许成熟的功能性驻留组织巨噬细胞填充宿主组织(6，7)。
我们确定在huHepMISTRGFah小鼠体内的人巨噬细胞亚群表达中央巨噬细胞标记CD169+(19，23，24)，并在EBI中发现，与几个分化阶段的人红系祖细胞密切接触。
HuHepMISTRGFah小鼠骨髓中的人红系前体细胞也缺乏与muC3的包被。
因此，肝脏人源化和细胞因子人源化相结合，可以在免疫有利的背景下研究中央巨噬细胞在人类红细胞生成中在健康和疾病中所起的作用。
SCD是一种遗传性血液疾病，由b-珠蛋白基因的单点突变引起，将第六种氨基酸谷氨酰胺突变为缬氨酸(25)。
最常见的SCD小鼠模型(26)仅在小鼠珠蛋白基因敲除(27-29)背景下的单核红细胞中表达人类珠蛋白。
小鼠模型对阐明SCD的许多病理机制做出了显著贡献。
然而，它们只含有muRBC，并未能捕捉到患者中遇到的遗传异质性，这使得灵活的人类SCD模型变得非常可取。
我们成功地将SCD HSPC植入huHepMISTRGFah小鼠体内，并在小鼠外周血中检测到循环中的镰状HuRBCs。
此外，我们观察了肺、脾、肝和肾的病理变化，这些变化与患者(30-33)的变化相似，并建立了SCD小鼠模型(27，29)。
在这里，我们介绍了我们的huHepMISTRGFah小鼠模型，该模型增强了人类红细胞的重建，更值得注意的是，成熟的循环HuRBCs。
我们的发现突出了该模型在众多危及生命的红细胞疾病研究中的潜力，这些疾病涉及全球5%的≈人口(34例)，包括阿尔法和β地中海贫血(35例)和SCD(25例)。
此外，这个模型在造血干细胞疾病的研究中可能很重要，比如骨髓发育不良症；红白血病；以及红细胞和肝脏错综复杂地联系在一起的病理学，比如疟疾。
因此，这种小鼠模型可能会为疾病病理生理机制的研究和治疗药物的临床前筛选开辟更多的途径。
信源：Yuanbin Song, et al. Combined liver–cytokine humanization comes to the rescue of circulating human red blood cells. Science 05 Mar 2021: Vol. 371, Issue 6533, pp. 1019-1025 DOI: 10.1126/science.abe2485
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