关于是不是要用同型对照，几十年下来，争议不断，这不，1999年这篇文章，还是值得我们再回头看看的。任何优点和缺点，都是在特定情况下的。

Keeney等人在《Isotype controls in the analysis of lymphocytes and CD34+ stem and progenitor cells by flow cytometry—time to let go!》中认为在计数CD34阳性干细胞，同种型对照没什么用处，实际上，在其它稀有事件分析的例子中，同种型对照确实用处也不大。同种型对照具有局限性，在Keeney的观点中得到了扩展，因为同型对照的作用，都可通过一些其他试剂、工具或先进的设门策略替代。 但是，O’Gorman在1999年写了篇Comment，提供了一些示例，认为有某些情况下，同型对照有用且确实值得推荐。

同型对照的缺陷

理论上，同型对照是作为“阴性对照”，即衡量的是抗体染色时的背景荧光或非特异性荧光。在理想情况下，根据同型对照设门，可以将同型对照以外的信号确定为目标抗体的特异性染色。不幸的是，同型对照并不是完美的阴性对照。原因如下：

（1）单克隆抗体是转化的杂交瘤细胞分泌的蛋白，因此尽管同型对照和目标抗体的免疫球蛋白的亚类可以匹配，但仍会存在细微的差异，因为这些杂交瘤不是正常细胞。

（2）尽管纯化、结合和再纯化单克隆抗体的程序已得到显著改善，但各批次之间或各公司之间的程序并不完全一致。

（3）即使免疫球蛋白亚类匹配、F/P比和浓度均一致，同型对照的背景结合能力可能仍然存在差异。

但是，O’Gorman认为，如果在了解了这些限制的情况下使用它们，那么它们可能会特别有用，并且对同型对照可以提供的信息不会有不切实际的期望。

同型对照值得应用的场景

同型对照对于新技术人员、新实验室、评估新的单克隆抗体试剂和/或建立新步骤特别有用。

同型对照产生的荧光在大多数情况下应该是基线或背景荧光，并可以优化细胞仪和单克隆抗体染色细胞阴性的参考点。

例如，如果一个在流式细胞术方面经验很少的新实验室想要测量存在于所有白细胞上的标记物，例如CD45或CD11b，那么在没有阴性对照样本的情况下可能难以优化设置。使用未染色的细胞作为背景荧光的对照是不合适的，因为单克隆抗体会以不同的量非特异性地结合在不同亚群上（例如淋巴细胞vs.单核细胞vs.粒细胞，三群的非特异性结合能力是不同的）。用非特异性同型对照抗体染色可以使用户确定目标亚组中的阴性水平。

再举个例子，粒细胞上如果不存在CD11b或CD11b的表达非常低，被认定为白细胞粘附缺陷型1，但由于中性粒细胞表达结合免疫球蛋白Fc受体，因此仅通过这些受体它们就结合更多的抗体。因此，在未确认粒细胞的背景染色会明显更高的情况下，比较粒细胞与淋巴细胞的抗原表达是有问题的。必须对目标抗体产生的“背景”染色量有所指示。匹配的同型对照提供了这样的工具。在这种情况下，这实际上不是“非特异性结合”，因为受体对免疫球蛋白分子的Fc部分具有特异性，即受体对抗体具有特异性，而抗体对受体则没有特异性。综上，为了评估粒细胞CD11b的染色模式，可使用同型对照染色的粒细胞调整细胞仪设置，使阴性对照粒细胞产生的荧光水平与阴性对照淋巴细胞产生的荧光水平匹配。

当您在特定的体外操作后评估特定表面标志物的上调或下调时，同型对照特别有用。

如果您想评估体外刺激后新抗原的出现或表达水平怎么办？如果没有同型对照，您是否会相信抗原表达上调是真实的？如果体外操作导致与目标单克隆抗体的非特异性结合显著增加，从而使抗原似乎已经表达，该怎么办？同型对照可用于控制这种情况。

当您试图评估组成性表达的抗原表达水平的增加时，也可能会问这个问题。表达的增加是由于抗原水平的提高，还是体外操作再次改变了细胞，使得任何抗体都会非特异性地粘附？没有同型对照，可能无法回答这个问题。

目前不存在于静息细胞上但会在体外活化后出现的抗原包括CD69和CD40配体CD154。流式可以通过检测淋巴细胞刺激活化后是否能上调CD154，筛查Hyper IgM综合征，具有该综合征的患者的T辅助细胞不能上调该抗原。在此实验中，重要的是得知道CD154表达的增加有多少是由于用佛波酯和钙离子载体刺激细胞而导致的非特异性结合所致。同型对照可用于此目的。

组成性表达抗原有一个例子是CD11b。具有中等程度白细胞粘附缺陷的患者，可能由于感染而使得CD11b基线水平升高，从而使他们的CD11b水平看上去似乎正常。然而，一旦激活，除非刺激方案引起非特异性结合增加，否则表达水平不应显著增加。激活过程本身可能导致粒细胞非特异性粘滞，从而导致CD11b明显增加。此时，用同种型对照，可以这种非特异性结合增加的程度。

当包含在白血病/淋巴瘤分型时，同型对照的纳入可能特别有用。

白血病/淋巴瘤分型我们常用内对照，即内部已知阴性细胞作为参照。但是，实际上同型对照还是蛮有用的，只不过不是你们平时用的那样。

（1）当评估低密度抗原表达，并且阳性和阴性群体分不开的时候，同型对照非常有用。

（2）同型对照样品还可以帮助我们评估特定抗体管中异常或意外的染色模式。同型对照管和特异性抗体管中出现类似非典型染色，可以让我们明确该染色模式与特异性抗原染色无关。例如，当对特定细胞群进行设门时，可能会看到特定抗原的整体荧光强度偏移，而又不知道该细胞群的染色是否特异性，这时，染一管同型对照+同样的设门抗体，如同型对照在此特定亚群上产生的染色模式相同，就可确定是非特异。

（3）同型对照还可以提供与样本相关有价值的信息，例如有些样品的活力差且细胞碎片很多，可以通过FSC或SSC与同型对照的散点图来确定非特异性染色的来源，并且在适当情况下将其排除。实际上，许多自动分析程序利用同型对照样品中的这类信息作为识别此类假事件的算法的一部分。

综上所述，现在与同型对照Say Goodbye还为时过早。在了解了它们的局限性后，可以让同型对照在合适的应用中发挥真正有效的作用。

Keeney M, Gratama JW, Chin-Yee IH, Sutherland DR. Isotype controls in the analysis of lymphocytes and CD34+ stem and progenitor cells by flow cytometry—time to let go!. Cytometry. 1998;34(6):280–283.
O’Gorman MR, Thomas J. Isotype controls—time to let go?. Cytometry. 1999;38(2):78–80.