最近，一位站友问道：

    我想请问一下，Annexin V/PI和CD57之类的表面标记物一起检测的话，染色的时候先后顺序要怎么做呢？

    这个问题，对于科研做的比较深入的FLOWER，确实是无法逃避的。因为无论如何，我们用的大多数样本都是混合的细胞，除非是细胞株。而且，有时候在研究细胞凋亡的同时，还希望能同时研究细胞的功能性标记。只有这样，才能充分发挥流式的多参数优势。

    Annexin V是一种36kDa的钙离子结合蛋白，可与凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸（PS）结合，从而可以检测出凋亡细胞。因此用于检测Annexin V的也是抗体，只不过结合环境需要钙离子参与。
    那么，其实我们就可以按下列步骤做染色上的调整：
    1、按常规步骤，染表面标记。
    2、用PBS洗涤两次。
    3、用100ul 1×Annexin V Binding Buffer重悬细胞，调整细胞密度，加入Annexin V抗体和PI。
    4、室温、避光10~15分钟。
    5、加入400ul1×Annexin V Binding Buffer，尽快上机（1小时内）。
    注：染色完成后要尽快上机检测，因为细胞在Annexin V结合缓冲液中存活时间不会太长。

    如果更极端的情况，你还希望进一步染胞内的标记，怎么做呢？
    可以考虑用1×Binding Buffer洗涤后，进行后续的固定、破膜等胞内染色操作，只是要做胞内染色的话，前面的PI尽量用商品化的针对胺类的死活染料替代。

    参考信源：
    https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_Protocol_AnnexinV_CellSurface_Antibody_Staining.pdf
    https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/annexin-v-staining-flow-cytometry.html#protocol-c