作者：Kim Le
什么叫非特异性抗体结合？
非特异性抗体结合就是指细胞表面没有特异性抗体结合靶点，却偏偏和抗体结合上了。
非特异性抗体结合的原因有很多。这里主要讲五个。
1、最常见的原因是抗体过量。当抗体浓度太高时，抗体将与亲和力低得多的靶标结合。
解决方案：通过使用滴定，优化抗体浓度，可以解决此问题。
2、另一个原因是抗体与Fc受体的结合。Fc受体是免疫细胞表面的抗体结合蛋白，例如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞和某些T细胞亚群。大多数商品化抗体都抗体包含Fc片段，或多或少都能与Fc受体结合。为了消除这个问题，可以使用Fc阻断剂（包含一种衍生自免疫球蛋白的重组蛋白），该蛋白将与Fc受体结合并最大程度地减少非特异性结合。有些供应商在其抗体试剂中包含Fc阻断剂，而有些则单独出售。
3、死细胞也可以是细胞成团和非特异性结合的来源。死细胞具有粘性，部分原因是其受损的细胞膜暴露了DNA。在染色方案中加入DNA结合染料（死活染料）（例如7-AAD或PI）可以排除死细胞。对于某些检测（例如CD34 +干细胞计数），此方法是必需的（请参阅CAP检查表FLO.30564）。如果方案中由于荧光搭配问题无法加入死活染料，则可用FSC/SSC散点图中的Viable门，也可以帮助区分活细胞和死细胞（请参见下面的示例）。
4、洗涤和染色缓冲液中缺少蛋白，也容易导致非特异性结合。所有细胞都能不同程度地粘附蛋白。如果洗涤液和染色缓冲液中缺少蛋白，抗体（本身也是一种蛋白）容易非特异性结合细胞并引起高背景荧光。可通过在这些缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA）或胎牛血清（FBS），轻松解决此问题。
5、抗体之间也可能发生相互作用，尤其是使用小鼠IgG2抗体时。这种相互作用是由血浆补体蛋白C1q介导的。为了防止这种不必要的关联，可以避免使用IgG2类抗体或在添加抗体之前去除血浆。去除血浆的方法主要有大体积洗涤2~3次，或用NH4Cl裂解液裂解后再进行单次PBS洗涤。
参考文献：
- Capel PJ, van de Winkel JG, van den Herik-Oudijk IE, Verbeek JS. Heterogeneity of human IgG Fc receptors. Immunomethods 1994; 4:25-34.
- Hulspas R, O’Gorman MRG, Wood BL, Gratama JW, Sutherland DR. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B 2009; 76B: 355-364.
- Wood BL, Levin GR. Interactions Between Mouse IgG2 Antibodies Are Common and Mediated by Plasma C1q. Cytometry B Clin Cytom. 2006 Sep 15; 70(5):321-8.
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