多序列比对有3个东西是大家基本认同的：
1.基因编码区的比对，需要采取基于密码子方式的比对；
2.目前多序列比对精确度：MAFFT>Muscle>Clustal；
3.多序列比对尽管是最基础的步骤，但是会影响后续的分析。
笔者最近发现了一个有趣的现象，不过也仅仅是这次处理的数据集才遇到，这让我重新审视了序列比对这个东西—-多序列比对尽可能选用精确度高的工具，且一定要仔细检查比对后的Alignment文件。
因为有时，对于某些数据，某种工具和某种方法比对的结果不一定是正常的(准确的)。
好了，接下来，我们故事开始：
笔者从NCBI下载了70条某个基因的基因编码区序列（已知是高度相似的），每条序列都从ATG起始密码子开始，如下：(截图仅显示了42条）
首先，选用了MEGA X里的Muscle(Codons)，也就是Muscle的基于密码子的比对方法，比对结果部分截图如下：
看上去好像有哪里不对劲，竟然在起始密码子(ATG)前引入了gap，尽管引入的gap数量是3个(3的倍数），但是gap引入位置不对，比对结果不合理，或者说前面9个碱基没比对正确。
换用MEGA X里的ClustalW(Codons)进行多序列比对，比对结果如下：
还是有很多序列在起始密码子(ATG)前引入了gap，比对结果不合理，和Muscle(Codons)的结果相差无几。
那如果不用基于密码子的方式比对呢？
换用MEGA X里的Muscle，这次采用不基于密码子的比对方法，比对结果如下：
嗯，结果看上去，所有序列都是以ATG起始了，而且引入的gap的数量也是3的倍数。
接下来看看，这种引入gap从生物学角度来看是否合理：
以EF203067和MF094681为例，其生物学意义是，如果考虑EF203067来自于MF094681的话，MF094681在其第二个密码子ACT在A和C之间插入了3个碱基(GTA),于是产生了EF203067的前9个碱基ATGAGTACT，相比于MF094681的前6个碱基“ATGACT”而言，这种插入碱基的方式，使得EF203067在该位置只是多了一个氨基酸而并没有发生移码突变，其他序列的插入碱基方式也没有造成移码突变，而这些序列已知是高度相似的，所以这种通过插入碱基而突变的方式是合理的。
尽管有一定的生物学意义，但是基因编码区不基于密码方式子比对，结果可能不太可靠。
换用MEGA X里的ClustalW，也采用不基于密码子的比对方法，结果如下：
和ClustalW基于密码子的比对方法的结果差不多，在ATG前引入了gap，比对结果不合理。
本示例中，为什么Muscle和ClustalW采用了基于密码子的方式比对结果不正常？
主要是数据的引起的。
由于这个插入发生的位置比较特殊，非常靠前，而比对中引入gap本身就是一个带有概率的随机事件，所以Muscle和ClustalW在尽管采取了基于密码子的方式比对，结果还是不尽人意。
通过上面的Muscle(Codons)和ClustalW(Codons)比对的结果，我们可以大致推测，自然界中真实的情况可能是，有几条序列在起始密码子ATG后面，从第4个碱基开始，直接插入了3个碱基，导致他们比其他序列在这个位置多了3个碱基(即多了1个氨基酸)。
这个故事告诉我们：一定要仔细检查比对后的Alignment文件 ！！！
既然问题已经发生了，重点在于怎么解决这个问题？
很明显，Muscle和ClustalW对于笔者的数据已经败下阵来，那MAFFT怎么样？
可是，好像MAFFT没有基于密码子的方式比对呀？
答案是有的，最新的两款生物信息学工具Phylosuite（张东博士）和BioAider（笔者），里面提供的MAFFT模块增加了MAFFT基于密码子的方式进行多序列比对。
使用东哥软件Phylosuite里的MAFFT基于密码子方式比对，将比对后的结果在MEGA X里显示如下：
注：笔者的数据分别用MAFFT里的E-INS-i策略(局部比对）和G-INS-i(全局比对）进行了测试，两种不同策略下，其结果是一模一样的，如上图所示。
使用MAFFT基于密码子的方式比对基因编码区，其结果基本正常了，而且证实了之前笔者的推测：自然界中真实的情况应该是，有几条序列相比其他序列在第1个密码子(ATG)的后面直接增加了3个碱基（比如EF203067），而那些少了3个碱基的序列（图中占大多数的那些序列）在比对时会在那个位置插入3个gap(-)。
多序列比对，还是推荐MAFFT，基因编码区的多序列比对，更加推荐使用MAFFT基于密码子的方式比对。
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