HISAT2

什么是HISAT2？

HISAT2是一种快速灵敏的比对程序，用于针对一般人群（以及针对单个参考基因组）作图的下一代测序读数（全基因组，转录组和外显子组测序数据）作图。基于GCSA（BWT的扩展（对于图形），我们就我们所知，设计并实现了图形FM索引（GFM），一种原始方法及其首次实现。除了使用一个代表总人口的全球GFM指数外，HISAT2还使用大量小型GFM指数，这些指数共同覆盖了整个基因组（每个指数代表56 Kbp的基因组区域，需要55,000个指数来覆盖人类人口）。这些小的索引（称为局部索引）与几种比对策略相结合，可实现序列读数的有效比对。这种新的索引方案称为层次图FM索引（HGFM）。我们已经基于HISAT和Bowtie2实现开发了HISAT 2 。HISAT2在SAM中输出对齐方式格式，可以与使用SAM的许多其他工具（例如SAMtools，GATK）互操作。HISAT2是根据GPLv3许可发行的，并且可以在Linux，Mac OS X和Windows下的命令行上运行。

从右侧的“发行”部分下载HISAT2源和二进制文件。二进制文件可用于x86_64运行Linux和Mac OS X的Intel体系结构（）。

从源头建造

首先，从右侧的“发行版”部分下载源程序包。将文件解压缩，转到解压缩后的目录，然后通过运行不带参数的GNU make（通常使用command make，但有时使用gmake）来构建HISAT2工具。如果使用MinGW进行构建，请make从MSYS环境中运行。

HISAT2正在使用多线程软件模型，以便在可能的情况下加快在SMP体系结构上的执行时间。在POSIX平台（例如linux，Mac OS等）上，它需要pthread库。尽管可以在非POSIX平台（例如Windows）上使用pthread库，但是由于性能原因，HISAT2会尽可能尝试使用Windows本机多线程。

为了在HISAT2中支持SRA数据访问，请下载并安装NCBI-NGS工具包。运行时make，请指定其他变量，如下所示。make USE_SRA=1 NCBI_NGS_DIR=/path/to/NCBI-NGS-directory NCBI_VDB_DIR=/path/to/NCBI-NGS-directory，其中NCBI_NGS_DIR和NCBI_VDB_DIR将在Makefile中用于-I和-L编译选项。例如，将使用（NCBI_NGS_DIR）/ lib64。

添加到PATH

通过将新的HISAT2目录添加到PATH环境变量中)，可以确保无论何时运行hisat2，hisat2-build或hisat2-inspect从命令行获取，只需获取刚刚安装的版本，而无需指定整个路径。建议大多数用户使用。为此，请按照操作系统的说明将目录添加到PATH中)。

如果您想通过HISAT2可执行文件复制到您的现有目录来安装HISAT2 PATH)，请确保您复制所有的可执行文件，包括hisat2，hisat2-align-s，hisat2-align-l，hisat2-build，hisat2-build-s，hisat2-build-l，hisat2-inspect，hisat2-inspect-s和hisat2-inspect-l。

报告中

报告模式控制着HISAT2查找多少个比对以及如何报告它们。

通常，当我们说读具有比对时，是指它具有有效的比对。当我们说读具有多个比对时，是指它具有有效且彼此不同的多个比对。

默认情况下，HISAT2可能会将其5’和3’末端附近的片段软剪切。用户可以通过设置软剪切（--sp）的不同惩罚或禁止软剪切（[ --no-softclip]）来控制此行为。

不同的比对将读段映射到不同的位置

如果相同的单个读段的两个比对将相同的读段映射到不同的位置，则它们是“不同的”。具体来说，我们说如果没有对齐位置，则在相同方向的两个对齐中都没有特定读取偏移量与特定参考偏移量对齐的对齐位置。例如，如果第一个对齐方式为正向，并且将读取偏移量为10处的阅读字符与第3号染色体上的参考字符（偏移量为3,445,245美元）对齐，并且第二个对齐方式也为正向对齐方式，并且还将读取的字符处为读取偏移量10个处相对于第3号染色体的参考字符，偏移量3,445,245，它们不是不同的比对。

如果两个配对末端比对中的配偶1不同，或者两个比对中的配偶2不同，或者两者都相同，则同一对的两个比对是不同的。

默认模式：搜索一个或多个比对，分别报告

HISAT2每次读取最多搜索N个不同的主要比对，其中N等于用-k参数指定的整数。主要比对是指比对分数等于或高于任何其他比对的比对。多个不同的比对可能具有相同的分数。也就是说，如果-k 2指定，HISAT2将搜索最多2个不同的比对。配对对齐的对齐分数等于各个配对的对齐分数之和。每个报告的读取或配对比对中的第一个比对都在其FLAGS字段中设置了SAM“第二”位（等于256）。有关详细信息，请参见SAM规范。

HISAT2不会以任何特定顺序“找到”比对，因此对于具有超过N个不同的有效比对的读取，HISAT2不能保证所报告的N个比对是比对得分最高的。尽管如此，在用户更关心读取是否对齐（或对齐特定次数）而不是其确切位置的情况下，此模式仍然有效且快速。

对齐摘要

当HISAT2完成运行时，它将打印消息，概述发生了什么。这些消息将打印到“标准错误”（“ stderr”）文件句柄中。对于由不成对的读取组成的数据集，摘要可能如下所示：

20000 reads; of these:
  20000 (100.00%) were unpaired; of these:
    1247 (6.24%) aligned 0 times
    18739 (93.69%) aligned exactly 1 time
    14 (0.07%) aligned >1 times
93.77% overall alignment rate

对于由对组成的数据集，摘要可能如下所示：

10000 reads; of these:
  10000 (100.00%) were paired; of these:
    650 (6.50%) aligned concordantly 0 times
    8823 (88.23%) aligned concordantly exactly 1 time
    527 (5.27%) aligned concordantly >1 times
    ----
    650 pairs aligned concordantly 0 times; of these:
      34 (5.23%) aligned discordantly 1 time
    ----
    616 pairs aligned 0 times concordantly or discordantly; of these:
      1232 mates make up the pairs; of these:
        660 (53.57%) aligned 0 times
        571 (46.35%) aligned exactly 1 time
        1 (0.08%) aligned >1 times
96.70% overall alignment rate

缩进表示小计与总计之间的关系。

包装纸

的hisat2，hisat2-build并且hisat2-inspect可执行文件实际上是包装脚本调用二进制程序适当。包装器使用户不必区分“小”和“大”索引格式，这将在下一节中简要讨论。此外，hisat2包装器还提供了一些关键功能，例如处理压缩输入的功能以及--un，--al和相关选项的功能。

大小索引

hisat2-build可以索引任何大小的参考基因组。对于长度少于约40亿个核苷酸的基因组hisat2-build，在索引的各个部分使用32位数字建立“小”索引。当基因组较长时，hisat2-build使用64位数字建立“大”索引。小索引存储在带有.ht2扩展名的文件中，大索引存储在带有.ht2l扩展名的文件中。用户不必担心特定索引的大小。包装脚本将自动构建并使用适当的索引。

性能调优

1. 如果您的计算机具有多个处理器/核心，请使用 -p
   该-p选项使HISAT2启动指定数量的并行搜索线程。每个线程在不同的处理器/内核上运行，并且所有线程并行查找对齐，从而使对齐吞吐量大约增加线程数量的倍数（尽管在实践中，加速比线性要差一些）。

命令行

设定功能选项

某些HISAT2选项指定功能而不是单独的编号或设置。在这些情况下，用户指定三个参数：（a）函数类型F，（b）常数项B，（c）系数A。可用的函数类型为常量（C），线性（L），平方根（S）和自然对数（G）。参数指定为F,B,A-即，函数类型，常数项和系数由逗号分隔，没有空格。常数项和系数可以是负数和/或浮点数。

例如，如果功能说明为L,-0.4,-0.6，则定义的功能为：

f(x) = -0.4 + -0.6 * x

如果功能说明为G,1,5.4，则定义的功能为：

f(x) = 1.0 + 5.4 * ln(x)

请参阅文档中有关该选项的信息，以了解该参数x的用途。例如，在该--score-min选项的情况下，该功能f(x)设置将对齐视为有效所必需的最小对齐分数，x即读取长度。

用法

hisat2 [options]* -x <hisat2-idx> {-1 <m1> -2 <m2> | -U <r> | --sra-acc <SRA accession number>} [-S <hit>]

主要参数

-x <hisat2-idx>

参考基因组索引的基名。basename是任何索引文件的名称，但不包括最后一个.1.ht2等后缀名。该索引文件hisat2首先在当前目录中查找指定的索引，然后在HISAT2_INDEXES环境变量中指定的目录中查找。

-1 <m1>

以逗号分隔的包含配对1的文件列表（文件名通常包含_1），例如-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq。使用此选项指定的序列必须与文件中的和与中读取的序列相对应<m2>。读取可能是不同长度的混合。如果-指定，hisat2将从“标准输入”或“ stdin”文件句柄中读取配合1。

-2 <m2>

以逗号分隔的包含伴侣2的文件列表（文件名通常包含_2），例如-2 flyA_2.fq,flyB_2.fq。使用此选项指定的序列必须与文件中的和与中读取的序列相对应<m1>。读取可能是不同长度的混合。如果-指定，hisat2将从“标准输入”或“ stdin”文件句柄中读取配合2s。

-U <r>

以逗号分隔的文件列表，其中包含要对齐的未配对读段，例如lane1.fq,lane2.fq,lane3.fq,lane4.fq。读取可能是不同长度的混合。如果-指定，hisat2则从“标准输入”或“ stdin”文件句柄中读取。

--sra-acc <SRA accession number>

SRA登录号的逗号分隔列表，例如--sra-acc SRR353653,SRR353654。有关读取类型的信息，请访问http://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?sp=runinfo&acc= sra -acc＆retmode = xml，其中sra -acc是SRA登录号。如果用户在计算机群集上运行HISAT2，建议禁用与SRA相关的缓存（请参阅SRA-MANUAL上的说明）。

-S <hit>

输出SAM文件的路径。默认情况下，对齐方式将写入“标准输出”或“标准输出”文件句柄（即控制台）。

选项

输入选项

-q

读取（与指定<m1>，<m2>，<s>）是FASTQ文件。FASTQ文件通常具有扩展名.fq或.fastq。FASTQ是默认格式。另请参阅：--solexa-quals和--int-quals。

--qseq

读取（与指定<m1>，<m2>，<s>）是QSEQ文件。QSEQ文件通常以结尾_qseq.txt。另请参阅：--solexa-quals和--int-quals。

-f

读取（与指定<m1>，<m2>，<s>）是FASTA文件。FASTA文件通常有扩展.fa，.fasta，.mfa，.fna或类似的。FASTA文件没有指定质量值的方法，因此-f设置后，结果就像--ignore-quals设置了一样。

-r

读取（与指定的<m1>，<m2>，<s>）是每行一个输入序列文件，而没有任何其他信息（没有读取名，无质量）。当-r设置，结果仿佛--ignore-quals也被设置。

-c

读取序列在命令行中给出。即<m1>，<m2>和<singles>以逗号分隔的列表中读取，而不是读取文件列表。无法指定读取的名称或质量，因此-c也意味着--ignore-quals。

-s/--skip <int>

跳过（即不对齐）输入中的第一个<int>读数或对。

-u/--qupto <int>

<int>从输入中对齐第一个读取或读取对（跳过-s/--skip读取或对后），然后停止。默认值：无限制。

-5/--trim5 <int>

<int>在对齐之前从每个读数的5’（左）末端修剪碱基（默认值：0）。

-3/--trim3 <int>

<int>在对齐之前，从每个读数的3’（右）末端修剪碱基（默认值：0）。

--phred33

输入质量是ASCII字符，等于Phred质量加33。这也称为“ Phred + 33”编码，最新的Illumina管线使用该编码。

--phred64

输入质量是ASCII字符，等于Phred质量加64。这也称为“ Phred + 64”编码。

--solexa-quals

将输入质量从Solexa（可以是负数）转换为Phred（不能）。此方案在较旧的Illumina GA Pipeline版本（1.3之前）中使用。默认值：关闭。

--int-quals

质量值在读取的输入文件中表示为以空格分隔的ASCII整数（例如40 40 30 40…），而不是ASCII字符（例如II?I…）。除非另有说明，否则将整数视为Phred质量等级--solexa-quals。默认值：关闭。

比对选项

--n-ceil <func>

设置一个函数，该函数根据读取长度来控制读取中允许的最大不明确字符数（通常为Ns和/或.s）。例如，指定-L,0,0.15将N上限函数设置f为f(x) = 0 + 0.15 * x，其中x是读取长度。另请参阅：[设置功能选项]。超出此上限的读数将被滤除。默认值：L,0,0.15。

--ignore-quals

在计算不匹配罚分时，无论实际值如何，始终将不匹配位置处的质量值视为最高。即，将输入视为所有质量值都很高。这也是当输入不指定质量值的默认行为（例如-f，-r或-c模式）。

--nofw/--norc

如果--nofw指定，hisat2则不会尝试将未配对的读取与正向（Watson）参考链对齐。如果--norc指定，hisat2则不会尝试将未配对的读数与反向互补（Crick）参考链对齐。在双端模式下，--nofw与--norc片段有关；即，指定--nofw原因hisat2以仅探索与反向互补（克里克）链片段相对应的那些配对末端构型。默认值：启用两个链。

计分选项

--mp MX,MN

设置最大（MX）和最小（MN）不匹配罚分，均为整数。小于或等于数MX和大于或等于MN从所述比对评分对每个位置读字符对准到基准字符，字符不匹配减去，也不是一个N。如果--ignore-quals指定，则数字减去quals MX。否则，减去的数字为MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) )Q为Phred质量值。默认值：MX= 6，MN= 2。

--sp MX,MN

设置每个基数的软剪切的最大（MX）和最小（MN）罚分，均为整数。从每个位置的对齐分数中减去一个小于或等于MX或大于或等于的数字MN。减去的数字是MN + floor( (MX-MN)(MIN(Q, 40.0)/40.0) )Q是Phred质量值。默认值：MX= 2，MN= 1。

--no-softclip

禁止软剪切。

--np <int>

为读取，引用或两者包含歧义字符（例如）的位置设置惩罚N。默认值：1。

--rdg <int1>,<int2>

将读取间隙设置为开放（<int1>）和扩展（<int2>）罚分。长度为N的读取间隙的代价为<int1>+ N * <int2>。默认值：5、3

--rfg <int1>,<int2>

将参考间隙设置为开放（<int1>）和扩展（<int2>）罚分。长度为N的参考间隙的惩罚为<int1>+ N * <int2>。默认值：5、3

--score-min <func>

设置一个功能，用于控制将比对视为“有效”（即足以报告）所需的最小比对分数。这是读取长度的函数。例如，指定L,0,-0.6将最小分数函数设置f为f(x) = 0 + -0.6 * x，其中x为读取长度。另请参阅：[设置功能选项]。默认值为L,0,-0.2。

拼接对齐选项

--pen-cansplice <int>

为每对规范的剪接位点（例如GT / AG）设置惩罚。默认值：0

--pen-noncansplice <int>

设置每对非规范剪接位点（例如非GT / AG）的惩罚。默认值：12

--pen-canintronlen <func>

设置带有标准剪接位点的长内含子的罚分，因此与较短的内含子相比，较短的内含子优先。默认值：G，-8,1

--pen-noncanintronlen <func>

设置具有非规范剪接位点的长内含子的罚分，因此与较短的内含子相比，较短的内含子比那些长的内含子更可取。默认值：G，-8,1

--min-intronlen <int>

设置最小内含子长度。默认值：20

--max-intronlen <int>

设置最大内含子长度。默认值：500000

--known-splicesite-infile <path>

使用此模式，您可以提供已知的剪接位点列表，HISAT2可以利用这些列表将读数与小锚点对齐。
您可以使用来创建这样的列表python hisat2_extract_splice_sites.py genes.gtf > splicesites.txt，hisat2_extract_splice_sites.pyHISAT2软件包中包含，其中是genes.gtf基因注释文件，并且splicesites.txt是以此模式提供HISAT2的剪接位点的列表。请注意，最好使用使用带注释的成绩单（例如基因组_tran或基因组_snp_tran）构建的索引，该索引比使用此选项更好。提供已经包含在索引中的拼接位点无效。

--novel-splicesite-outfile <path>

在这种模式下，HISAT2报告文件中的剪接位点列表 ：侧翼碱基在右链（+，-和。）’ 的内含子基因组位置左侧的
染色体名称<tab>基因组位置。表示非规范剪接位点的未知链。<tab>``<tab>

--novel-splicesite-infile <path>

使用此模式，您可以提供从上述选项“ —novel-splicesite-outfile”生成的新颖的拼接站点列表。

--no-temp-splicesite

缺省情况下，HISAT2利用早期读取发现的剪接位点来对齐同一运行中的后续读取，尤其是具有较小锚点（<= 15 bp）的读取。

--no-spliced-alignment

禁用拼接对齐。

--rna-strandness <string>

指定特定于链的信息：默认为无链。
对于单端读取，请使用F或R。“ F”表示读取对应于笔录。“ R”是指读段对应于转录本的反向互补的对应部分。对于双端读取，请使用FR或RF。
使用此选项时，每个读段比对都将具有XS属性标签：“ +”表示读段属于基因组“ +”链上的转录本。“-”表示读段属于基因组“-”链上的转录本。
（TopHat有一个类似的选项—library-type选项，其中fr-firststrand对应于R和RF； fr-secondstrand对应于F和FR。）

--tmo/--transcriptome-mapping-only

仅报告已知成绩单中的那些比对。

--dta/--downstream-transcriptome-assembly

为包括StringTie在内的脚本汇编程序量身定制的报告对齐方式。使用此选项，HISAT2需要更长的锚长度才能从头发现拼接位点。这样可以减少与短锚的对齐，这有助于转录汇编程序显着提高计算和内存使用率。

--dta-cufflinks

报告专门为袖扣定制的对齐方式。除了HISAT2可以使用上述选项（—dta）之外，HISAT2还可以通过三个信号（GT / AG，GC / AG，AT / AC）寻找新颖的拼接位点，但是所有用户提供的拼接位点不论其信号如何使用。

--no-templatelen-adjustment

禁用RNA-seq读取的模板长度调整。

报告选项

-k <int>

它<int>为每次读取最多搜索不同的主要比对。主要比对是指比对分数等于或高于任何其他比对的比对。当找不到更多不同的有效比对或找到时，搜索将终止<int>，以先发生的为准。配对对齐的对齐分数等于各个配对的对齐分数之和。每个报告的读取或配对比对中的第一个比对都在其FLAGS字段中设置了SAM“第二”位（等于256）。对于具有比完全<int>有效的比对更多的读段，hisat2不能保证<int>报告的比对在比对得分方面是最好的。默认值：5（HFM）或10（HGFM）

注意：HISAT2在设计时并未考虑到较大的值-k，将读数与较长的重复基因组-k进行比对时，可能会非常非常慢。

--max-seeds <int>

HISAT2与其他程序一样，使用种子和扩展方法。HISAT2尝试将种子扩展到全长比对。在HISAT2中，-max-seeds用于控制将要扩展的最大种子数。HISAT2扩展到许多种子，并跳过其余的种子。较大的值--max-seeds可能会提高比对敏感性，但HISAT2并非为--max-seeds考虑较大的值而设计，将读取序列与长的重复基因组--max-seeds进行比对时，可能会非常非常慢。默认值为最大值5和随附的值-k。

--secondary

报告二级对齐。

配对端选项

-I/--minins <int>

有效的成对末端比对的最小片段长度。此选项仅对—no-spliced-alignment有效。例如，如果-I 60指定并且配对末端比对包含两个处于适当方向的20 bp比对，且它们之间有20 bp的间隔，则认为该比对是有效的（只要-X也可以满足）。在这种情况下，19 bp的缺口将无效。如果使用修剪选项-3或-5也使用修剪选项，则将-I约束应用于未修剪的配合。

-I和之间的差异越大-X，HISAT2的运行速度就越慢。这是因为HISAT2 之间的差异较大，-I并且-X需要HISAT2扫描较大的窗口才能确定是否存在一致的对齐方式。对于典型的片段长度范围（200至400个核苷酸），HISAT2非常有效。

默认值：0（基本上没有最小值）

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-X/--maxins <int>

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有效的成对末端比对的最大片段长度。该选项仅对—no-spliced-alignment有效。例如，如果-X 100指定并且配对末端比对包含两个正确方向的20 bp比对，且两者之间有60 bp的间隔，则认为该比对是有效的（只要-I也可以满足）。在这种情况下，61bp的缺口将无效。如果使用-3或修剪选项-5，则-X约束将应用于未修剪的配合，而不是修剪的配合。

-I和之间的差异越大-X，HISAT2的运行速度就越慢。这是因为HISAT2 之间的差异较大，-I并且-X需要HISAT2扫描较大的窗口才能确定是否存在一致的对齐方式。对于典型的片段长度范围（200至400个核苷酸），HISAT2非常有效。

默认值：500。

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--fr/--rf/--ff

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相对于前向参考链的有效成对末端对齐的上游/下游交配方向。例如，如果--fr已指定并且存在一个候选的配对末端比对，其中配偶1出现在配偶2的反向互补序列的上游，并且满足片段长度约束（-I和-X），则该比对有效。同样，如果配合2出现在配合1的反向补语的上游，并且满足了所有其他约束，则这也是有效的。--rf同样要求上游mate1反向补充，下游mate2向前定向。--ff需要上游配合1和下游配合2都朝前。默认值：（--fr适用于Illumina的配对末端测序分析）。

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--no-mixed

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默认情况下，当hisat2无法找到一对的一致或不一致的对齐方式时，它将尝试查找单个伴侣的对齐方式。此选项禁用该行为。

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--no-discordant

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默认情况下，hisat2如果找不到不一致的路线，则查找不一致的路线。甲不和谐对准是其中两个配合对齐唯一的取向，但不满足配对末端约束（--fr/ --rf/--ff，-I，-X）。此选项禁用该行为。

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输出选项

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-t/--time

打印加载索引文件和对齐读数所需的时钟时间。这被打印到“标准错误”（“ stderr”）文件句柄中。默认值：关闭。

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--un <path>
--un-gz <path>
--un-bz2 <path>

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写入未配对的读取，该读取无法与处的文件对齐<path>。这些读取对应于将FLAGS 0x4位置1且0x40NOR或1 0x80位置1 的SAM记录。如果--un-gz指定，输出将被gzip压缩。如果--un-bz2指定，输出将被bzip2压缩。以这种方式写入的读取将与输入文件中的显示完全相同，而无需进行任何修改（相同的序列，相同的名称，相同的质量字符串，相同的质量编码）。读取不一定按照与输入相同的顺序出现。

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--al <path>
--al-gz <path>
--al-bz2 <path>

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写入不成对的读取，该读取至少一次对齐到的文件<path>。这些读取对应举着旗的SAM记录0x4，0x40以及0x80位取消设置。如果--al-gz指定，输出将被gzip压缩。如果--al-bz2指定，输出将被bzip2压缩。以这种方式写入的读取将与输入文件中的显示完全相同，而无需进行任何修改（相同的序列，相同的名称，相同的质量字符串，相同的质量编码）。读取不一定按照与输入相同的顺序出现。

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--un-conc <path>
--un-conc-gz <path>
--un-conc-bz2 <path>

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写成对的末尾读取未能与处的文件一致对齐<path>。这些读出对应于SAM记录与FLAGS 0x4位设置和任一0x40或0x80（取决于它的伴侣＃1或＃2）比特集。.1和.2字符串添加到文件名，以区分哪个文件包含配对＃1和配对＃2。如果在%中使用<path>了百分号，则百分号将替换为1或2来制作每个伴侣的文件名。否则，.1或.2添加在最后一个点之前<path>制作每个队友的文件名。以这种方式写入的读取将与输入文件中的显示完全相同，而无需进行任何修改（相同的序列，相同的名称，相同的质量字符串，相同的质量编码）。读取不一定按照与输入相同的顺序出现。

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--al-conc <path>
--al-conc-gz <path>
--al-conc-bz2 <path>

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写入配对末端读取，该读取至少一次与处的文件一致对齐<path>。这些读取对应于未0x4设置FLAGS 位并且设置了0x40或0x80位的SAM记录（取决于它是伴侣＃1还是＃2）。.1和.2字符串添加到文件名，以区分哪个文件包含配对＃1和配对＃2。如果在%中使用<path>了百分号，则百分号将替换为1或2来制作每个伴侣的文件名。否则，.1或.2添加在最后一个点之前<path>制作每个队友的文件名。以这种方式写入的读取将与输入文件中的显示完全相同，而无需进行任何修改（相同的序列，相同的名称，相同的质量字符串，相同的质量编码）。读取不一定按照与输入相同的顺序出现。

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--quiet

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除了对齐和严重错误外，什么也不打印。

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--summary-file

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将对齐摘要打印到此文件。

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--new-summary

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以新样式打印对齐摘要，这对机器更友好。

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--met-file <path>

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将hisat2指标写入文件<path>。具有对齐度量标准对于调试某些问题（尤其是性能问题）很有用。另请参阅：--met。默认值：指标已禁用。

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--met-stderr

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将hisat2指标写入“标准错误”（“ stderr”）文件句柄。这与不互斥--met-file。具有对齐度量标准对于调试某些问题（尤其是性能问题）很有用。另请参阅：--met。默认值：指标已禁用。

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--met <int>

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每秒钟写入一个新的hisat2指标记录<int>。仅当指定--met-stderr或时才重要--met-file。默认值：1。

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SAM选项

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--no-unal

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禁止对未对齐的读取进行SAM记录。

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--no-hd

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禁止SAM标头行（以开头@）。

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--no-sq

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禁止@SQSAM标头行。

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--rg-id <text>

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将读取的组ID设置为<text>。这将导致@RG打印SAM 标头行，并将其<text>作为与ID:标签关联的值。它还使RG:Z:多余字段附加到每个SAM输出记录，其值设置为<text>。

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--rg <text>

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加入<text>（通常的形式TAG:VAL，例如SM:Pool1）为对一个字段@RG的标题行。注意：为了@RG显示该行，--rg-id还必须指定。这是因为SAM SpecID需要标签。多次指定以设置多个字段。有关哪些字段合法的详细信息，请参见SAM规范。--rg

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--remove-chrname

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从对齐方式的引用名称中删除“ chr”（例如，chr18至18）

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--add-chrname

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将“ chr”添加到对齐的参考名称中（例如18至chr18）

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--omit-sec-seq

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打印辅助路线时，默认情况下，HISAT2将写出SEQ和QUAL字符串。指定此选项会使HISAT2在这些字段中打印一个星号。

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性能选项

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-o/--offrate <int>

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用覆盖索引的非标率<int>。如果<int>大于用于构建索引的取消速率，则在将索引读入内存时会丢弃某些行标记。这减少了对齐器的内存占用，但需要更多时间来计算文本偏移量。<int>必须大于用于建立索引的值。

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-p/--threads NTHREADS

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启动NTHREADS并行搜索线程（默认值：1）。线程将在单独的处理器/内核上运行，并在解析读取和输出对齐时进行同步。搜索路线高度平行，并且加速接近线性。增加会-p增加HISAT2的内存占用量。例如，当与人类基因组索引对齐时，-p从1增加到8会使内存占用量增加几百兆字节。该选项仅在bowtie与pthreads库链接时才可用（即，如果BOWTIE_PTHREADS=0在构建时未指定）。

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--reorder

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即使-p设置为大于1 ，也可以保证输出SAM记录的打印顺序与原始输入文件中读取的顺序相对应。指定--reorder和设置为-p大于1会使HISAT2的运行速度稍慢，并且使用的内存更多，则如果--reorder未指定。如果-p设置为1 则无效，因为在这种情况下输出顺序自然会对应于输入顺序。

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--mm

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使用内存映射的I / O加载索引，而不是典型的文件I / O。内存映射允许bowtie同一台计算机上的许多并发进程共享索引的相同内存映像（即，您只需支付一次内存开销）。这有助于bowtie在-p无法使用或不推荐使用的情况下实现内存有效的并行化。

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其他选择

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--qc-filter

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筛选出QSEQ筛选器字段不为零的读取。仅当读取格式为时才有效--qseq。默认值：关闭。

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--seed <int>

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使用<int>作为种子的伪随机数发生器。默认值：0

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--non-deterministic

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通常，HISAT2为每个读取重新初始化其伪随机数生成器。它使用（a）读取名称，（b）核苷酸序列，（c）质量序列，（d）--seed期权价值衍生的数字为生成器播种。这意味着，如果两个读段是相同的（相同的名称，相同的核苷酸，相同的质量），即使存在歧义，HISAT2也会发现并报告两个序列的相同比对。时--non-deterministic指定，HISAT2重新初始化使用当前时间读取为它的每个伪随机发生器。这意味着HISAT2不一定会为两个相同的读数报告相同的比对。对于某些用户来说，这是违反直觉的，但在输入包含许多相同的读数的情况下可能更合适。

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--version

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打印版本信息并退出。

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-h/--help

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打印使用情况信息并退出。

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SAM输出

以下是SAM输出的SAM格式的简要说明hisat2。有关更多详细信息，请参见SAM格式规范。

默认情况下，hisat2打印头SAM用@HD，@SQ和@PG线条。当--rg指定一个或多个参数时，hisat2还将打印@RG一行，其中包括所有--rg由制表符分隔的用户指定的标记。

随后的每一行都描述一个对齐，或者如果读取未能对齐，则描述一个读取。每行是由制表符分隔的至少12个字段的集合；从左到右，这些字段是：

1. 对齐的读取名称。
   请注意，SAM规范不允许读取名称中包含空格。如果读取的名称包含任何空格字符，则HISAT2将在第一个空格字符处截断该名称。这类似于其他工具的行为。
2. 所有适用标志的总和。与HISAT2有关的标志是：
   |

   1

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阅读是一对
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|

2

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比对是正确的成对末端比对的一端
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|

4

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读取没有报告的比对
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8

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读数是一对，没有报告的比对
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16

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对准反向参考链
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32

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配对末端对齐中的另一对与反向参考链对齐
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64

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读取是一对配对1
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128

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读取是一对配对2
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因此，与反向参考链对齐的未配对读段将具有标志16。对齐且是该对中的第一个配对的成对末端读段将具有标志83（= 64 + 16 + 2 + 1）。

1. 发生比对的参考序列名称
2. 基于1的偏移到前向参考链中发生比对的最左字符
3. 映射质量
4. CIGAR对齐方式的字符串表示形式
5. 发生配偶对齐的参考序列的名称。设置为=，如果队友的参考序列相同，这种对齐的，或者*如果没有队友。
6. 基于1的偏移到前向参考链中，在该位置出现配对对齐的最左字符。如果没有配合，则偏移为0。
7. 推断的片段长度。如果配合的对齐发生在该对齐的上游，则大小为负。如果伙伴未一致对齐，则大小为0。但是，如果配偶不一致对齐同一条染色体，则大小为非0。
8. 读取序列（如果与反向链对齐，则为反向互补）
9. ASCII编码的读取质量（如果读取与反向链对齐，则为反向互补）。与FASTQ文件类似，编码的质量值在Phred质量等级上，编码的ASCII偏移量为33（ASCII字符!）。
10. 可选字段。字段以制表符分隔。hisat2根据路线的类型，为每个路线输出零个或多个这些可选字段：

|

AS:i:

 | 
对齐分数。可以为负。仅在SAM记录用于对齐读取时才存在。
 |
|

ZS:i:

 | 
除了报告的比对以外，找到了得分最高的比对的比对分数。可以为负。仅当SAM记录用于对齐的读取并且发现该读取有多个对齐时才存在。注意，当读段是一致排列的对的一部分时，该分数可能大于\[ `AS:i`\]。
 |
|

YS:i:

 | 
配对末端对齐中相对配对的对齐分数。仅当SAM记录是作为成对末端比对的一部分进行比对的读取时才显示。
 |
|

XN:i:

 | 
参考文献中含糊不清的碱基数涵盖了此对齐方式。仅在SAM记录用于对齐读取时才存在。
 |
|

XM:i:

 | 
比对中的不匹配数。仅在SAM记录用于对齐读取时才存在。
 |
|

XO:i:

 | 
对齐中针对读取和参考间隙的间隙数均打开。仅在SAM记录用于对齐读取时才存在。
 |
|

XG:i:

 | 
对齐中读取和参考缺口的缺口延伸数。仅在SAM记录用于对齐读取时才存在。
 |
|

NM:i:

 | 
编辑距离；也就是说，将读取的字符串转换为参考字符串所需的最小数量的单核苷酸编辑（取代，插入和删除）。仅在SAM记录用于对齐读取时才存在。
 |
|

YF:Z:

 | 
字符串，指示读取内容被滤除的原因。另请参阅：\[过滤\]。仅针对已过滤掉的读取出现。
 |
|

 | 
的值`UU`表示读取的内容不属于一对。值`CP`表示读段是一对的一部分，并且该对一致对齐。值`DP`表示读段是一对的一部分，并且该对不一致对齐。值`UP`表示读段是一对的一部分，但该对未能一致或不一致排列。
 |
|

 | 
比对中不匹配的参考碱基的字符串表示形式。有关详细信息，请参见[SAM](http://samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf)格式规范。仅在SAM记录用于对齐读取时才存在。
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|

 | 
的值`+`和`-`表示读取分别映射到有义和反义链上的转录本。拼接的对齐方式需要具有此字段，袖扣和StringTie中需要此字段。  
我们可以报告该字段用于规范剪接站点（GT / AG），但不能报告非规范剪接站点。您可以使用“ --pen-noncansplice 1000000”指示HISAT2不要输出此类对齐方式（涉及非规范的拼接位点）。
 |
|

 | 
读取或配对的映射位置数。
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|

 | 当读取的比对涉及索引中的SNP时，此选项用于指示读取确切地涉及SNP的位置。此可选字段类似于上面的MD：Z字段。例如，`Zs:Z:1|S|rs3747203,97|S|rs16990981`表示读取的第二个碱基对应于已知的SNP（ID：rs3747203）。在第三个碱基之后的97个碱基（第二个碱基之后的碱基），在第100个碱基处的读取涉及另一个已知的SNP（ID：rs16990981）。“ S”表示单核苷酸多态性。“ D”和“ I”分别表示删除和插入。 |

hisat2-build [options]* <reference_in> <ht2_base>

If you use --snp, --ss, and/or --exon, hisat2-build will need about 200GB RAM for the human genome size as index building involves a graph construction. 
Otherwise, you will be able to build an index on your desktop with 8GB RAM.

<reference_in>

<ht2_base>

-f

-c

--large-index

-a/--noauto

--bmax <int>

--bmaxdivn <int>

--dcv <int>

--nodc

-r/--noref

-3/--justref

-o/--offrate <int>

-t/--ftabchars <int>

--localoffrate <int>

--localftabchars <int>

-p <int>

--snp <path>

--haplotype <path>

--ss <path>

--exon <path>

--seed <int>

--cutoff <int>

-q/--quiet

-h/--help

--version

hisat2-inspect [options]* <ht2_base>

<ht2_base>

-a/--across <int>

-n/--names

-s/--summary

Colorspace  <0 or 1>
SA-Sample   1 in <sample>
FTab-Chars  <chars>
Sequence-1  <name>  <len>
Sequence-2  <name>  <len>
...
Sequence-N  <name>  <len>

--snp

--ss

--ss-all

--exon

-v/--verbose

--version

-h/--help

$HISAT2_HOME/hisat2-build $HISAT2_HOME/example/reference/22_20-21M.fa --snp $HISAT2_HOME/example/reference/22_20-21M.snp 22_20-21M_snp

$HISAT2_HOME/hisat2 -f -x $HISAT2_HOME/example/index/22_20-21M_snp -U $HISAT2_HOME/example/reads/reads_1.fa -S eg1.sam

head eg1.sam

@HD     VN:1.0  SO:unsorted
@SQ     SN:22:20000001-21000000 LN:1000000
@PG     ID:hisat2       PN:hisat2       VN:2.0.0-beta
1       0       22:20000001-21000000    397984  255     100M    *       0       0       GCCTGTGAGGGAGCCCCGGACCCGGTCAGAGCAGGAGCCTGGCCTGGGGCCAAGTTCACCTTATGGACTCTCTTCCCTGCCCTTCCAGGAGCAGCTCACT    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU NH:i:1
2       16      22:20000001-21000000    398131  255     100M    *       0       0       ATGACACACTGTACACACCAGGGGCCCTGTGCTCCCCAGGAAGAGGGCCCTCACTTGAAGCGGGGCCCGATGGCCGCCACGTGCCGGTTCATGCTCCCCT    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:80A19      YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:80|S|rs576159895
3       16      22:20000001-21000000    398222  255     100M    *       0       0       TGCTCCCCTTGGCCCCGCCGATGTTCAGGGACATGGAGCGCTGCAGCAGGCTGGAGAAGATCTCCACTTGGTCAGAGCTGCAGTACTTGGCGATCTCAAA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:16A83      YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:16|S|rs2629364
4       16      22:20000001-21000000    398247  255     90M200N10M      *       0       0       CAGGGACATGGAGCGCTGCAGCAGGCTGGAGAAGATCTCCACTTGGTCAGAGCTGCAGTACTTGGCGATCTCAAACCGCTGCACCAGGAAGTCGATCCAG    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU XS:A:-  NH:i:1
5       16      22:20000001-21000000    398194  255     100M    *       0       0       GGCCCGATGGCCGCCACGTGCCGGTTCATGCTCCCCTTGGCCCCGCCGATGTTCAGGGACATGGAGCGCTGCAGCAGGCTGGAGAAGATCTCCACTTGGT    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:17A26A55   YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:17|S|rs576159895,26|S|rs2629364
6       0       22:20000001-21000000    398069  255     100M    *       0       0       CAGGAGCAGCTCACTGAAATGTGTTCCCCGTCTACAGAAGTACCGTGATACACAGACGCCCCATGACACACTGTACACACCAGGGGCCCTGTGCTCCCCA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU NH:i:1
7       0       22:20000001-21000000    397896  255     100M    *       0       0       GTGGAGTAGATCTTCTCGCGAAGCACATTGCAGATGGTTGCATTTGGAACCACATCGGCATGCAGGAGGGACAGCCCCAGGGTCAGCAGCCTGTGAGGGA    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:31G68      YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:31|S|rs562662261
8       0       22:20000001-21000000    398150  255     100M    *       0       0       AGGGGCCCTGTGCTCCCCAGGAAGAGGGCCCTCACTTGAAGCGGGGCCCGATGGCCGCCACGTGCCGGTTCATGCTCCCCTTGGCCCCGCCGATGTTCAG    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:61A26A11   YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:61|S|rs576159895,26|S|rs2629364
9       16      22:20000001-21000000    398329  255     8M200N92M       *       0       0       ACCAGGAAGTCGATCCAGATGTAGTGGGGGGTCACTTCGGGGGGACAGGGTTTGGGTTGACTTGCTTCCGAGGCAGCCAGGGGGTCTGCTTCCTTTATCT    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:100        YT:Z:UU XS:A:-  NH:i:1
10      16      22:20000001-21000000    398184  255     100M    *       0       0       CTTGAAGCGGGGCCCGATGGCCGCCACGTGCCGGTTCATGCTCCCCTTGGCCCCGCCGATGTTCAGGGACATGGAGCGCTGCAGCAGGCTGGAGAAGATC    IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII    AS:i:0  XN:i:0  XM:i:0  XO:i:0  XG:i:0  NM:i:0  MD:Z:27A26A45   YT:Z:UU NH:i:1  Zs:Z:27|S|rs576159895,26|S|rs2629364

$HISAT2_HOME/hisat2 -f -x $HISAT2_HOME/example/index/22_20-21M_snp -1 $HISAT2_HOME/example/reads/reads_1.fa -2 $HISAT2_HOME/example/reads/reads_2.fa -S eg2.sam

$HISAT2_HOME/hisat -f -x $HISAT2_HOME/example/index/22_20-21M_snp -1 $HISAT2_HOME/example/reads/reads_1.fa -2 $HISAT2_HOME/example/reads/reads_2.fa -S eg2.sam

samtools view -bS eg2.sam > eg2.bam

samtools sort eg2.bam -o eg2.sorted.bam

samtools mpileup -uf $HISAT2_HOME/example/reference/22_20-21M.fa eg2.sorted.bam | bcftools view -bvcg - > eg2.raw.bcf

bcftools view eg2.raw.bcf