参考：https://www.bilibili.com/video/BV13t411372E?p=50

多序列比对，multiple alignment，是对两条以上的生物序列进行全局比对。

多序列比对的主要用途

1.确认：一个未知的序列是否属于某个家族；

2.建立：系统发生树，查看物种间或者序列间的关系；

3.模式识别：一些特别保守的序列片段往往对应重要的功能区域，通过多序列比对，可以找到这些保守片段；

4.已知推未知：把已知有特殊功能的序列片段通过多序列比对做成模型，然后根据该模型推测未知的序列片段是否也具有该功能；

5.其他：预测蛋白质/RNA 二级结构等等。

多序列比对工具

目前市面上的多序列比对工具都不是很完美，因为多序列比对的复杂度和双序列比对不是一个数量级的。你可以想象二维打分矩阵，但n维，是不是就太复杂了？

因此多序列比对算法，牺牲了准确度，以提升速度。

多序列比对注意事项

对序列的要求

1. 序列的数量不能太多。一般10-15条，最好别超过50条。
2. 序列的亲缘关系不能太远。两两之间序列相似度低于30%的一组序列，进行多序列比对的结果没有意义，甚至无法进行比对。
3. 序列的亲缘关系不能太近。两两之间序列相似度高于90%的一组序列，进行再多的比对也是等于比对一条。
4. 序列长度不能太短。多序列比对只支持差不多长的序列。
5. 序列不能包含重复域。如果序列中包含过多的重复片段，序列比对的程序可能会报错。

对序列命名的要求

1. 名字里不能有空格，可以用“_”代替空格。
2. 不要用特殊字符，比如中文、@、#、¥、%等等。
3. 名字的长度不要超过15个字符。
4. 一组序列里，不要有重名的序列。
5. 如果不按上述几点命名，多序列比对工具会自动地修改序列，以符合规范。

多序列比对工具

EMBL 的网页工具

embl 真是提供了太多的工具以供使用。

cluster omega

• 这熟悉的界面～ 我们接着用参考序列
  
• 我们直接使用默认值即可
  
• submit 就好
• 比对结果
  
  ps：一般来说，设置的aligned 排列规则可能会导致输出结果的序列顺序发生改变。
• 显示序列颜色
  
  红色表示为保守序列
• 同样也有对应符号的特殊含义
  

通过解读这些符号，我们可以了解保守区域的位置——一般来说是*与: 比较密集的地方。

• 查看结果总结
  

了解序列间关系

• Percent Identity Matrix
  

第一列和第一行是一样的。其实我们只要看对角线一侧的结果就可以了，因为它们都是一样顺序对比的，结果也是对称的。
这个矩阵可以告诉我们所有矩阵两两之间的序列一致度。

• Phylogenetic Tree 系统发生树
  

其实这个树本名应该叫guide tree，只是embl 在制作时，将结果发送给了做系统发生树的软件，所以形成了相同的构造。（并没有进行距离校正）因而不同作为系统发生树。
ps：现在的版本已经将guide tree 与Phylogenetic Tree 分隔开了。

Tcoffee

和clustal 系列算法上类似，但准确度上比clustal 系列略高，并且计算耗时上也略高。

另外，tcoffee 有很多变形，也意味着它有更多的功能。许多网站都提供tcoffee 的使用工具。

http://tcoffee.crg.cat/

• Tcoffee 对于不同类型的序列，也提供了更进一步的比对工具。（其实是更多种类的咖啡）

Expresso 为序列加入结构信息，使结果更加准确。 M-coffee 把多个序列比对结果整合一个。 PSI/TM-coffee 专为穿膜蛋白打造。 PSI-coffee 专为远源序列打造。

expresso，蛋白质多序列比对

继续使用网站的示例序列。

• 可以通过各种方式给入结构信息

如果有现成的结构文件（PDB），也可以直接上传。

也可以使用模版或通过系统自动查找

ps：一般计算需要比较久的时间，因此最好留个邮箱。

从结果来看，通过颜色反映对比结果的好坏。越好越红，越蓝越坏。

而对比单纯地用T-coffee的话，expresso 也能给出更为精准的结果。

多序列比对保存格式

无论是cluster omega 还是tcoffee ，都提供了多种序列比对的保存格式。

选择合适的保存格式

多序列比对结果的编辑工具

Jalview

http://www.jalview.org/

在embl 的Multiple Sequence Alignment工具下，result 中也提供了jalview，可以快速启动。但需要注意的是，但这个在线版本功能不全。

软件版本的jalview 提供了更为全面的功能，且关联了非常多的数据库。

jalview 的软件界面

可以非常清晰地看到，jalview 有很多的功能。包括彩色显示，以及蛋白质结构，系统发生树等。

我们可以导入通过clustal omega 形成的.clustal 文件（多序列比对的结果）。

保守区、质量区、共有序列（所有序列出现频率最高的字母，如果是两个或两个以上字母，则显示+）

上色

color 下有很多种颜色供我们选择。
percentage identity 可以和 conservation 下的结果相匹配，会用深浅不同的蓝色表示。

通过调整by conservation，调整颜色出现的阈值。

• 还可以根据clustal 结果上色，和clustal 比对网页中的颜色结果是相同的。
  

表格中表示了不同氨基酸有不同的颜色方案。

编辑序列

调整界面显示及图片导出

通过-format-wrap ，实现换行。

如果觉得字体太小，还可以通过format-font，进行调整。

如果我们只想要序列比对部分，不想要柱状图的注释。可以通过view-show annotation 取消。

我们还可以通过 calculate-sort 给比对中的序列排序。

还可以通过 calculate-pairwise alignment 为它们做双序列比对。

还可以通过选中不同的序列，通过 calculate-calculate tree 为它们做系统进化树。

还可以通过web service 为选中的某个序列做蛋白质二级结构预测。

弄好了一切，那就把图片导出来给大伙看看吧！

其他多序列比对美化工具