前面我们通过 GATK 的 mutect 流程找到了 somatic mutations，但是只有突变的染色体和坐标信息，我们并不知道该突变发生在哪个基因或者哪号外显子，显然通过坐标进行手动查看的方法是不科学的。应该通过软件来实现，这里我们比较四个vcf注释软件的安装及使用：vep、annovar、gatk funcatator、snpeff

这一节我们将比较不同注释软件(vep,annovar,gatk funcatator,snpeff) 的安装及使用，按照我的代码习惯，都需要一个 config3 文件来完成批量处理，与前面的 config 文件区别在于，这里仅剩下肿瘤的样本名：

  1. $ cat config
  2. case1_biorep_A_techrep
  3. case2_biorep_A
  4. case3_biorep_A
  5. case4_biorep_A
  6. case5_biorep_A
  7. ......

ANNOVAR

安装

直接到官网：http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/download/，注册需要教育邮箱，获取到安装包后，解压便可使用，当然还需要下载数据库数据：

  1. cd ~/wes_cancer/biosoft
  2. # wget 下载地址
  3. tar -zxvf annovar.latest.tar.gz
  4. cd annovar
  5. nohup ./annotate_variation.pl -downdb -webfrom annovar gnomad_genome --buildver hg38 humandb/ >down.log 2>&1 &

数据量非常大，不过看个人所需下载，我这里其实下载了很多不必要的注释文件，当然可能以后会用到：

  1. 41G    humandb/

如果想下载指定数据库的注释文件，可以先获取数据库注释文件列表

  1. $ ./annotate_variation.pl -downdb -buildver hg38 -webfrom annovar avdblist hg38_list/
  2. $ cat hg38_list/hg38_avdblist.txt 
  3. hg38_abraom.txt.gz    20191205    23148851
  4. hg38_abraom.txt.idx.gz    20191205    9831917
  5. hg38_avsnp142.txt.gz    20191205    1282852569
  6. hg38_avsnp142.txt.idx.gz    20191205    212764014
  7. hg38_avsnp144.txt.gz    20191205    1671400214
  8. hg38_avsnp144.txt.idx.gz    20191205    215204030
  9. hg38_avsnp147.txt.gz    20191205    1775686247
  10. hg38_avsnp147.txt.idx.gz    20191205    222202148
  11. hg38_avsnp150.txt.gz    20191205    3794169304
  12. hg38_avsnp150.txt.idx.gz    20191205    234261780
  13. ......

注释

在曾老师的博客中有多篇博文介绍它的用法，但主要看：ANNOVAR软件用法还可以更复杂：http://www.bio-info-trainee.com/4007.html，主要有3种类型的注释：

  • 基于基因的注释， exonic,splicing,ncRNA,UTR5,UTR3,intronic,upstream,downstream,intergenic，使用 geneanno 子命令。
  • 基于区域的注释， cytoBand,TFBS,SV,bed,GWAS,ENCODE,enhancers,repressors,promoters ，使用regionanno 子命令。只考虑位点坐标
  • 基于数据库的过滤， dbSNP,ExAC,ESP6500,cosmic,gnomad,1000genomes,clinvar 使用 filter 子命令。 考虑位点坐标同时关心突变碱基情况。

而本文中，用 ANNOVAR 对 vcf 文件所做的是基于基因的注释，注释脚本annovar.sh如下：

  1. cat config | while  read id
  2. do
  3. echo "start ANNOVAR for ${id} " `date`
  4. ~/biosoft/annovar/table_annovar.pl ./6.mutect/${id}_filter.vcf ~/biosoft/annovar/humandb/ \
  5. -buildver hg38 \
  6. -out ./7.annotation/annovar/${id} \
  7. -remove \
  8. -protocol refGene,knownGene,clinvar_20170905 \
  9. -operation g,g,f \
  10. -nastring . \
  11. -vcfinput
  12. echo "end ANNOVAR for ${id} " `date`
  13. done

注释的速度非常快，一个样本大概就是6~7秒就可以注释完，每个样本输出3个文件：

  1. case1_biorep_A_techrep.avinput
  2. case1_biorep_A_techrep.hg38_multianno.txt
  3. case1_biorep_A_techrep.hg38_multianno.vcf

在文件case1_biorep_A_techrep.hg38_multianno.txt中的一个突变记录位点注释上的信息如下：

  1. chr1    6146376 6146376 G       T       exonic  CHD5    .       nonsynonymous SNV       CHD5:NM_015557:exon11:c.C1638A:p.N546K  exonic  CHD5    .       nonsynonymous SNV       CHD5:uc001amb.3:exon11:c.C1638A:p.N546K,CHD5:uc057btb.1:exon11:c.C1638A:p.N546K .       .       .       .       .       0.25    .
  2.        75      chr1    6146376 .       G       T       .       PASS    DP=184;ECNT=1;NLOD=22.56;N_ART_LOD=-1.888e+00;POP_AF=1.000e-05;P_CONTAM=0.00;P_GERMLINE=-4.514e+01;TLOD=5.41    GT:AD:AF:F1R2:F2R1:MBQ:MFRL:MMQ:MPOS:SA_MAP_AF:SA_POST_PROB     0/1:97,3:0.058:48,1:49,2:37,38:154,210:60:20:0.020,0.030,0.030:0.018,3.223e-03,0.979    0/0:75,0:0.020:45,0:30,0:36,0:154,0:0:0

GATK funcatator注释(要加interval文件)

在前面的mutect流程中，有提到了funcatator，现在我们就来实际使用，看看结果如何

8 不同 vcf 注释软件的安装及使用 - 图1

安装

注释只用到一个工具：Funcotator，帮助文档在：https://software.broadinstitute.org/gatk/documentation/tooldocs/4.1.4.1/org_broadinstitute_hellbender_tools_funcotator_Funcotator.php，需要注意的是，不同 GATK 版本所有到的参数可能不同，结果也不完全一致。这里我们使用最新版本的gatk-4.1.4.1的 Funcotator 工具来做注释，方法比较简单，首先需要下载数据库文件，前面本文已经下载过了，14G 左右的文件，解压后是 18G ，这里不再演示具体下载方法，简单来说就是下面代码：

  1. cd ~/wes_cancer/data
  2. nohup wget -c ftp://gsapubftp-anonymous@ftp.broadinstitute.org/bundle/funcotator/funcotator_dataSources.v1.6.20190124s.tar.gz &
  3. tar -zxvf funcotator_dataSources.v1.6.20190124s.tar.gz

注释

然后使用GATK的Funcotator工具进行在线注释。

根据官网的教程https://software.broadinstitute.org/gatk/documentation/tooldocs/4.1.4.1/org_broadinstitute_hellbender_tools_funcotator_Funcotator.php，需要一个interval文件，interval文件和bed文件基本一致，只不过bed文件的坐标是从“0”开始编号，而interval_list文件是从“ 1”开始编号。这里我们已有bed文件，用gatk的BedToIntervalList工具可以转成interval：

  1. GATK=~/wes_cancer/biosoft/gatk-4.1.4.1/gatk
  2. bed=~/wes_cancer/data/hg38.exon.bed
  3. dict=~/wes_cancer/data/Homo_sapiens_assembly38.dict
  5. $GATK BedToIntervalList -I ${bed} -O hg38.exon.interval_list -SD ${dict}

准备好interval文件后回到工作目录

  1. cd ~/wes_cancer/project

用到的脚本Funcotator.sh如下（经评论区读者指出，脚本需要添加对 vcf 创建索引，已更正）：

  1. GATK=~/wes_cancer/biosoft/gatk-4.1.4.1/gatk
  2. ref=~/wes_cancer/data/Homo_sapiens_assembly38.fasta
  3. interval=~/wes_cancer/data//hg38.exon.interval_list
  4. source=~/wes_cancer/data/funcotator_dataSources.v1.6.20190124s
  5. cat config | while read id
  6. do
  7.     echo "start Funcotator for ${id} " `date`
  8.   $GATK IndexFeatureFile --input ./6.mutect/${id}_filter.vcf
  9.     $GATK  Funcotator -R $ref \
  10.     -V ./6.mutect/${id}_filter.vcf \
  11.     -O ./7.annotation/funcotator/${id}_funcotator.tmp.maf \
  12.     --data-sources-path ${source} \
  13.     --intervals ${interval} \
  14.     --output-file-format MAF \
  15.     --ref-version hg38 
  16.     echo "end Funcotator for ${id} " `date`
  17. done

注释的速度也相当快，一个样本 10 秒左右就注释好了，同样我们以 case1_biorep_A_techrep 这个样本为例，打开查看一下结果，这里跳过了头文件：

  1. $ less ./7.annotation/funcotator/case1_biorep_A_techrep_funcotator.maf | grep -v '^#' | head -2
  2. Hugo_Symbol    Entrez_Gene_Id    Center    NCBI_Build    Chromosome    Start_Position    End_Position    Strand    Variant_Classification    Variant_Type    Reference_Allele    Tumor_Seq_Allele1    Tumor_Seq_Allele2    dbSNP_RS    dbSNP_Val_Status    Tumor_Sample_Barcode    Matched_Norm_Sample_Barcode    Match_Norm_Seq_Allele1    Match_Norm_Seq_Allele2    Tumor_Validation_Allele1    Tumor_Validation_Allele2    Match_Norm_Validation_Allele1    Match_Norm_Validation_Allele2    Verification_Status    Validation_Status    Mutation_Status    Sequencing_Phase    Sequence_Source    Validation_Method    Score    BAM_File    Sequencer    Tumor_Sample_UUID    Matched_Norm_Sample_UUID    Genome_Change    Annotation_Transcript    Transcript_Strand    Transcript_Exon    Transcript_Position    cDNA_Change    Codon_ChangProtein_Change    Other_Transcripts    Refseq_mRNA_Id    Refseq_prot_Id    SwissProt_acc_Id    SwissProt_entry_Id    Description    UniProt_AApos    UniProt_Region    UniProt_Site    UniProt_Natural_Variations    UniProt_Experimental_Info    GO_Biological_Process    GO_Cellular_Component    GO_Molecular_Function    COSMIC_overlapping_mutations    COSMIC_fusion_genes    COSMIC_tissue_types_affected    COSMIC_total_alterations_in_gene    Tumorscape_Amplification_Peaks    Tumorscape_Deletion_Peaks    TCGAscape_Amplification_Peaks    TCGAscape_Deletion_Peaks    DrugBank   ref_context    gc_content    CCLE_ONCOMAP_overlapping_mutations    CCLE_ONCOMAP_total_mutations_in_gene    CGC_Mutation_Type    CGC_Translocation_Partner  CGC_Tumor_Types_Somatic    CGC_Tumor_Types_Germline    CGC_Other_Diseases    DNARepairGenes_Activity_linked_to_OMIM    FamilialCancerDatabase_Syndromes    MUTSIG_Published_Results    OREGANNO_ID    OREGANNO_Values    tumor_f    t_alt_count    t_ref_count    n_alt_count    n_ref_count    Gencode_27_secondaryVariantClassification  ACMGLMMLof_LOF_Mechanism    ACMGLMMLof_Mode_of_Inheritance    ACMGLMMLof_Notes    ACMG_recommendation_Disease_Name    ClinVar_VCF_AF_ESP    ClinVar_VCF_AF_EXAC    ClinVar_VCF_AF_TGP    ClinVar_VCF_ALLELEID    ClinVar_VCF_CLNDISDB    ClinVar_VCF_CLNDISDBINCL    ClinVar_VCF_CLNDN    ClinVar_VCF_CLNDNINCL    ClinVar_VCF_CLNHGVS    ClinVar_VCF_CLNREVSTAT    ClinVar_VCF_CLNSIG    ClinVar_VCF_CLNSIGCONF    ClinVar_VCF_CLNSIGINCL    ClinVar_VCF_CLNVC    ClinVar_VCF_CLNVCSO    ClinVar_VCF_CLNVI  ClinVar_VCF_DBVARID    ClinVar_VCF_GENEINFO    ClinVar_VCF_MC    ClinVar_VCF_ORIGIN ClinVar_VCF_RS    ClinVar_VCF_SSR    ClinVar_VCF_ID    ClinVar_VCF_FILTER    LMMKnown_LMM_FLAGGED    LMMKnown_ID    LMMKnown_FILTER    DP    ECNT    IN_PON    NLOD    N_ART_LOD    POP_AF    P_CONTAM    P_GERMLINE    RPA    RU    STR    TLOD    
  3. CHD5    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    hg38    chr1    6146376    6146376    +    Nonsense_Mutation    SNP    G    G    T    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN____UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    NA    NA    __UNKNOWN__    __UNKNOWN____UNKNOWN__    g.chr1:6146376G>T    ENST00000262450.7    -    11    173c.1638C>A    c.(1636-1638)tgC>tgA    p.C546*        __UNKNOWN__    __UNKNOWN____UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN____UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    CATCCATGTCGTTCTTTCTTT    0.5860349127182045    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN__    __UNKNOWN____UNKNOWN__    __UNKNOWN__    0.058    3    97    0    75           false            184    1        22.56    -1.888e+00    1.000e-05  0.00    -4.514e+01                5.41

可以看到这个工具一下子注释了几十个数据库，有一百多列的信息，当然很多注释结果是 __UNKNOWN__。

vep注释

在以前如要要用 vep 的话，安装比较麻烦，甚至需要管理员权限：http://www.bio-info-trainee.com/1600.html

也可以参考ensemble数据库对应的安装教程：http://asia.ensembl.org/info/docs/tools/vep/script/vep_download.html

强烈推荐，使用 conda 来安装 vep ，因为下面的教程写的比较早，就不修改了。

里面介绍了多种方法，最后一种是用 docker 装 vep，比较麻烦一点，但是也不难，需要学习一下 docker，也是需要管理员权限，这个方法的好处在于，docker 的 vep 镜像中已经把各种模块配置好了，启动镜像就可以用 vep注释，不需要下载，如果你有管理员权限，可以尝试这种方法。如果没有管理员权限，也可以购买一台配置较低的阿里云服务器（如果是学生还有优惠套餐，9.5 元/月）。对于这台服务器，你就有管理员权限啦，安装方法见上面的链接，这里就不再演示了（其实我也有试了其他几种方法的，但是最后都因为 perl 安装依赖模块缺失而放弃）

安装docker

  1. sudo apt install docker-ce
  2. docker --version
  3. sudo add-apt-repository "deb [arch=amd64] https://download.docker.com/linux/ubuntu artful stable"
  4. sudo docker run hello-world

用docker安装vep镜像

  1. docker pull ensemblorg/ensembl-vep
  2. docker run -t -i ensemblorg/ensembl-vep ./vep
  3. # Create a directory on your machine:
  4. mkdir $HOME/vep_data
  6. # Make sure that the created directory on your machine has read and write access granted
  7. # so the docker container can write in the directory (VEP output):
  8. chmod a+rwx $HOME/vep_data    
  10. docker run -t -i -v $HOME/vep_data:/opt/vep/.vep ensemblorg/ensembl-vep
  11. docker run -t -i -v $HOME/vep_data:/opt/vep/.vep ensemblorg/ensembl-vep perl INSTALL.pl -a cfp -s homo_sapiens -y GRCh38 -g all

启动镜像

根据上面的教程，我们在家目录中新建了一个vep_data的文件夹，然后把我们需要注释的vcf文件拷贝到vep_data目录下，然后启动vep镜像：

  1. sudo docker run -t -i -v $HOME/vep_data:/opt/vep/.vep ensemblorg/ensembl-vep

注释

用vep注释的脚本vep.sh如下：

  1. cat /opt/vep/.vep/wes_cancer/project/config | while read id
  2. do
  3. echo "start vep_annotation for ${id} " `date`
  4. ./vep --cache --offline --format vcf --vcf --force_overwrite \
  5. --dir_cache /opt/vep/.vep/ \
  6. --dir_plugins /opt/vep/.vep/Plugins/ \
  7. --input_file /opt/vep/.vep/wes_cancer/project/6.mutect/${id}_filter.vcf \
  8. --output_file /opt/vep/.vep/wes_cancer/project/7.annotation/vep/${id}_vep.vcf 
  9. echo "end vep_annotation for ${id} " `date`
  10. done

注释后结果，每个样本会输出两个文件，一个是vcf文件，一个是html文件，如：

  1. case1_biorep_A_techrep_vep.vcf
  2. case1_biorep_A_techrep_vep.vcf_summary.html

同样的，我们查看一下样本case1_biorep_A_techrep_vep.vcf注释的结果，可以发现，vep的注释结果就是在原先的vcf文件的INFO列后面注释上了很多的信息，这些信息以|符号作为分隔

  1. #CHROM    POS    ID    REF    ALT    QUAL    FILTER    INFO    FORMAT    case1_biorep_A_techrep    case1_germline
  2. chr1    6146376 .       G       T       .       PASS    DP=184;ECNT=1;NLOD=22.56;N_ART_LOD=-1.888e+00;POP_AF=1.000e-05;P_CONTAM=0.00;P_GERMLINE=-4.514e+01;TLOD=5.41;CSQ=T|missense_variant|MODERATE|CHD5|ENSG00000116254|Transcript|ENST00000262450|protein_coding|11/42||||1936|1638|546|N/K|aaC/aaA|||-1||HGNC|HGNC:16816,T|upstream_gene_variant|MODIFIER|CHD5|ENSG00000116254|Transcript|ENST00000462991|nonsense_mediated_decay|||||||||||2272|-1|cds_start_NF|HGNC|HGNC:16816,T|missense_variant&NMD_transcript_variant|MODERATE|CHD5|ENSG00000116254|Transcript|ENST00000496404|nonsense_mediated_decay|11/34||||1638|1638|546|N/K|aaC/aaA|||-1||HGNC|HGNC:16816        GT:AD:AF:F1R2:F2R1:MBQ:MFRL:MMQ:MPOS:SA_MAP_AF:SA_POST_PROB     0/1:97,3:0.058:48,1:49,2:37,38:154,210:60:20:0.020,0.030,0.030:0.018,3.223e-03,0.979    0/0:75,0:0.020:45,0:30,0:36,0:154,0:0:0

SNPEFF注释

安装

snpeff的安装方法也比较简单，参考：

http://snpeff.sourceforge.net/download.html#source

  1. cd ~/wes_cancer/biosoft
  2. # Download latest version
  3. wget http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/snpEff_latest_core.zip
  5. # Unzip file
  6. unzip snpEff_latest_core.zip

对于数据库文件，我们需要下载人类参考基因组 hg38 版本的注释文件 Homo_sapiens，但是：By default SnpEff automatically downloads and installs the database for you, so you don’t need to do it manually. 软件默认下载了 GRCh38.86 ，所以我们不需要自己下载，如果需要其他数据库，可以通过下面命令查询和获取下载的链接，有 20000 多个 database，足够了，不过需要注意一下版本的问题：

  1. java -jar snpEff.jar databases | less -S

8 不同 vcf 注释软件的安装及使用 - 图2

注释

对于癌症样本，有其特定的注释方法：

http://snpeff.sourceforge.net/SnpEff_manual.version_4_0.html#cancer

需要一个 samples_cancer.txt 文件，内容如下：

  1. $ cat ~/wes_cancer/biosoft/snpeff/samples_cancer.txt
  2. case1_germline  case1_biorep_A_techrep
  3. case2_germline  case2_biorep_A
  4. case3_germline  case3_biorep_A
  5. case4_germline  case4_biorep_A
  6. case5_germline  case5_biorep_A
  7. ......

注释的脚本snpeff.sh如下

  1. dir=~/wes_cancer/project/7.annotation/
  2. config=~/wes_cancer/project/config
  3. cat ${config} | while read id
  4. do
  5. echo "start snpeff_annotation for ${id} " `date`
  6. java -Xmx4g -jar snpEff.jar -v \
  7. -cancer -cancerSamples ./7.annotation/snpeff/samples_cancer.txt \
  8. GRCh38.86 \
  9. ./6.mutect/${id}_filter.vcf > ./7.annotation/snpeff/${id}_eff.vcf 
  10. echo "end snpeff_annotation for ${id} " `date`
  11. done

这个运行速度比较慢一些，一个样本大概需要一分钟的时间，我们还是来看一下注释的结果，同样以这个样本case1_biorep_A_techrep为例：

$ head -1 case1_biorep_A_techrep_eff.vcf
chr1    6461445    .    G    T    .    PASS    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同样是在原来的 vcf 文件的INFO列添加了许多注释信息，这里仅仅是该样本的第一个 vcf 突变位点，就注释上了大量的信息，主要是这个位点刚好处于多个基因上，且每个基因有多个转录本。这个结果和 vep 注释后拿到的结果非常相似。