差异分析的套路都是差不多的，大部分设计思想都是继承limma这个包，DESeq2也不例外。
DESeq2是DESeq包的更新版本，看样子应该不会有DESeq3了，哈哈，它的设计思想就是针对count类型的数据。
可以是任意features的count数据，比如对各个基因的count，或者外显子，或者CHIP-seq的一些feature，都可以用来做差异分析。
使用这个包也是需要三个数据：

  • 表达矩阵
  • 分组矩阵
  • 差异比较矩阵

总结起来三个步骤，我下面会一一讲解

  • 重点就是构造一个dds的对象，
  • 然后直接用DESeq函数进行normalization处理即可，
  • 处理之后用results函数来提取差异比较结果。

读取自己的数据
一般我们会自己读取表达矩阵和分组信息，下面是一个例子：

  1. options(warn=-1)
  2. suppressMessages(library(DESeq2))
  3. suppressMessages(library(limma))
  4. suppressMessages(library(pasilla))
  6. data(pasillaGenes)
  7. exprSet=counts(pasillaGenes)
  8. head(exprSet)  ##表达矩阵如下
  9. ##             treated1fb treated2fb treated3fb untreated1fb untreated2fb
  10. ## FBgn0000003          0          0          1            0            0
  11. ## FBgn0000008         78         46         43           47           89
  12. ## FBgn0000014          2          0          0            0            0
  13. ## FBgn0000015          1          0          1            0            1
  14. ## FBgn0000017       3187       1672       1859         2445         4615
  15. ## FBgn0000018        369        150        176          288          383
  16. ##             untreated3fb untreated4fb
  17. ## FBgn0000003            0            0
  18. ## FBgn0000008           53           27
  19. ## FBgn0000014            1            0
  20. ## FBgn0000015            1            2
  21. ## FBgn0000017         2063         1711
  22. ## FBgn0000018          135          174
  23. (group_list=pasillaGenes$condition)
  24. ## [1] treated   treated   treated   untreated untreated untreated untreated
  25. ## Levels: treated untreated
  26. ##这是分组信息，7个样本，3个处理的，4个未处理的对照！

第一步：构建dds对象

那么根据这两个数据就可以构造dds的对象了

  1. colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet), 
  2.                        group_list=group_list
  3.                        )
  5. ## 这是一个复杂的方法构造这个对象！
  6. dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
  7.                               colData = colData,
  8.                               design = ~ group_list)
  9. ## design 其实也是一个对象，还可以通过design(dds)来继续修改分组信息，但是一般没有必要。
  11. dds
  12. ## class: DESeqDataSet 
  13. ## dim: 14470 7 
  14. ## exptData(0):
  15. ## assays(1): counts
  16. ## rownames(14470): FBgn0000003 FBgn0000008 ... FBgn0261574
  17. ##   FBgn0261575
  18. ## rowData metadata column names(0):
  19. ## colnames(7): treated1fb treated2fb ... untreated3fb untreated4fb
  20. ## colData names(1): group_list

可以看到我们构造的dds对象有7个样本，共14470features
从基因名可以看出，是果蝇的测序数据
我们也可以直接从expressionSet这个对象构建dds对象！

  1. library(airway)
  3. data(airway)
  5. suppressMessages(library(DESeq2))
  7. dds  <- DESeqDataSet(airway, design = ~ cell+ dex)
  8. design(dds) <- ~ dex  
  9. ## 构造好的对象还可以更改分组信息

第二步：做normalization

  1. suppressMessages(dds2 <- DESeq(dds)) 
  3. ##直接用DESeq函数即可
  4. ## 下面的代码如果你不感兴趣不需要运行，免得误导你
  5. ## 就是看看normalization前面的数据分布差异
  6. rld <- rlogTransformation(dds2)  ## 得到经过DESeq2软件normlization的表达矩阵！
  7. exprSet_new=assay(rld)
  8. par(cex = 0.7)
  9. n.sample=ncol(exprSet)
  10. if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
  11. cols <- rainbow(n.sample*1.2)
  12. par(mfrow=c(2,2))
  13. boxplot(exprSet, col = cols,main="expression value",las=2)
  14. boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
  15. hist(exprSet)
  16. hist(exprSet_new)

image.png

第三步：提取差异分析结果

  1. resultsNames(dds2)
  2. ## [1] "Intercept"           "group_listtreated"   "group_listuntreated"
  4. ## 其实如果只分成了两组，并没有必要指定这个比较矩阵！
  5. res <-  results(dds2, contrast=c("group_list","treated","untreated")) 
  7. ## 提取你想要的差异分析结果，我们这里是trt组对untrt组进行比较
  8. resOrdered <- res[order(res$padj),]
  9. resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
  10. head(resOrdered)
  11. ##              baseMean log2FoldChange     lfcSE      stat        pvalue
  12. ## FBgn0039155  453.2753      -4.281830 0.1919977 -22.30146 3.576174e-110
  13. ## FBgn0029167 2165.0445      -2.182745 0.1080670 -20.19807  1.017931e-90
  14. ## FBgn0035085  366.8279      -2.436860 0.1505280 -16.18875  6.054219e-59
  15. ## FBgn0029896  257.9027      -2.511257 0.1823764 -13.76964  3.881667e-43
  16. ## FBgn0034736  118.4074      -3.166392 0.2375506 -13.32933  1.562878e-40
  17. ## FBgn0040091  610.6035      -1.526400 0.1278555 -11.93848  7.457520e-33
  18. ##                      padj
  19. ## FBgn0039155 2.764025e-106
  20. ## FBgn0029167  3.933795e-87
  21. ## FBgn0035085  1.559769e-55
  22. ## FBgn0029896  7.500351e-40
  23. ## FBgn0034736  2.415897e-37
  24. ## FBgn0040091  9.606528e-30

差异分析结果很容易看懂啦！
原文来自：www.bio-info-trainee.com