简介

在发育过程中，细胞对刺激作出反应，并在整个生命过程中，从一种功能“状态”过渡到另一种功能“状态”。不同状态的细胞表达不同的基因，产生蛋白质和代谢物的动态重复序列，从而完成它们的工作。当细胞在状态之间移动时，它们经历一个转录重组的过程，一些基因被沉默，另一些基因被激活。这些瞬时状态通常很难描述，因为在更稳定的端点状态之间纯化细胞可能是困难的或不可能的。单细胞RNA-Seq可以使您在不需要纯化的情况下看到这些状态。然而，要做到这一点，我们必须确定每个cell在可能的状态范围内的位置。
Monocle介绍了利用RNA-Seq进行单细胞轨迹分析的策略。Monocle不是通过实验将细胞纯化成离散状态，而是使用一种算法来学习每个细胞必须经历的基因表达变化序列，作为动态生物学过程的一部分。一旦它了解了基因表达变化的整体“轨迹”，Monocle就可以将每个细胞置于轨迹中的适当位置。然后，您可以使用Monocle的微分分析工具包来查找在轨迹过程中受到调控的基因，如查找作为伪时间函数变化的基因一节所述。如果这个过程有多个结果，Monocle将重建一个“分支”轨迹。这些分支与细胞的“决策”相对应，Monocle提供了强大的工具来识别受它们影响的基因，并参与这些基因的形成。在分析单细胞轨迹中的分支的小节中，您可以看到如何分析分支。

monocle 能做的不只是拟时分析，或者说为了做拟时分析他也做了sc-rna-seq的基本分析流程：数据读入，均一化，降维（PCA，umap,tsne,），聚类，marker基因筛选以及可视化函数。在新的学习中我们发现monocle能做的远不只这些，例如用shiny开发了web程序，更加用户友好；借助garnett包可以做细胞定义——-monocle已经是一个sc-rna-seq数据分析的工具箱。

使用Monocle3对多样本单细胞数据进行伪时间分析 - 图1

Monocel对象的生成

Monocle的cds对象其实在一定程度上非常类似于Seurat，只不过表示方法不一样，所以，我们可以很容易的从Seurat中取出需要的数据载入Monocle3

具体方法可以参考简书:scRNA-seq数据分析 || Monocle3

但是，monocle软件有自己的一套流程，囊括了标准化，归一化，降维，聚类等等，所以一般来说，我们都需要提供原始的未经处理的表达矩阵，但是，由于我们是整合了多样本的结果，而我们又不想使用monocle的批次效应去除方法，我们该怎么导入呢？

方法就是我们导入Seurat多样本整合并标准化的结果矩阵，然后，在后面的预处理过程中，取消掉标准化。

  1. library(Seurat)
  2. library(monocle3)
  3. endo<-readRDS("DC.rds")
  4. DefaultAssay(endo)<-"integrated"
  5. data <- endo@assays$integrated@data
  6. pd <-  endo@meta.data
  7. #the metadata have many rubbish info,we delete it
  8. new_pd<-select(pd,stim,nCount_RNA,nFeature_RNA,percent.mt)
  9. new_pd$Cell.type<-Idents(endo)
  10. head(new_pd)
  11.                      stim nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt
  12. AAACCTGGTATCAGTC-1_1 CTRL       4835         1383   3.536711
  13. AACCGCGCATTCCTGC-1_1 CTRL       4029         1230   2.655746
  14. AACGTTGAGCCCAATT-1_1 CTRL       2576          918   3.377329
  15. AAGACCTGTGGTTTCA-1_1 CTRL       2841         1044   5.455825
  16. AAGTCTGCATGAAGTA-1_1 CTRL       3731         1213   3.886358
  17. ACAGCCGCATCGGACC-1_1 CTRL       5915         1918   3.043111
  18.                                      Cell.type
  19. AAACCTGGTATCAGTC-1_1                       DC2
  20. AACCGCGCATTCCTGC-1_1                      MDSC
  21. AACGTTGAGCCCAATT-1_1                      MDSC
  22. AAGACCTGTGGTTTCA-1_1 Dendritic.cells.activated
  23. AAGTCTGCATGAAGTA-1_1                      MDSC
  24. ACAGCCGCATCGGACC-1_1 Dendritic.cells.activated
  26. fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
  27. #create new cds obj
  29. cds <- new_cell_data_set(data,cell_metadata  = new_pd,gene_metadata  = fData)

预处理

数据scale并采用PCA降纬

  1. #we use normalized data,so we do not normalize it
  2. cds <- preprocess_cds(cds, num_dim = 30,norm_method = "none")

如果你非要使用Monocle的批次效应功能，可以尝试,batch列必须在你的pData里面

  1. cds <- align_cds(cds, alignment_group = "batch")

采用umap的方法运行非线性降维

  1. #umap
  2. cds <- reduce_dimension(cds,umap.n_neighbors = 20L)
  3. #color by seurat cluster
  4. plot_cells(cds,label_groups_by_cluster=FALSE,color_cells_by = "cell.type")

使用Monocle3对多样本单细胞数据进行伪时间分析 - 图2

细胞聚类

  1. #cluster
  2. cds <- cluster_cells(cds,resolution = 0.5)
  3. #color by monocle cluster
  4. plot_cells(cds, color_cells_by = "partition",label_groups_by_cluster=FALSE)

使用Monocle3对多样本单细胞数据进行伪时间分析 - 图3

伪时间构建

其实说白了，就是基于图形以及表达量的变化关系，构建一个个基于起始表达的进化线或者说是分支，这里面肯定既有节点又有分枝。

  1. cds <- learn_graph(cds)

画图展示：

  1. plot_cells(cds,color_cells_by = "Cell.type",label_groups_by_cluster=FALSE,label_leaves=TRUE,label_branch_points=TRUE)

使用Monocle3对多样本单细胞数据进行伪时间分析 - 图4

定义起始节点&&伪时间分析

起始节点可以基于现有的知识，比如你已经将细胞类型注释好了，其中某种细胞就是起始的早期细胞，我们就可以把它作为root,如果不知道，我们只能使用1在的细胞群作为起始了

一个有用的定义根节点的函数

  1. get_earliest_principal_node <- function(cds, time_bin="Dendritic.cells.activated"){
  2.   cell_ids <- which(colData(cds)[, "Cell.type"] == time_bin)
  3.   closest_vertex <-
  4.   cds@principal_graph_aux[["UMAP"]]$pr_graph_cell_proj_closest_vertex
  5.   closest_vertex <- as.matrix(closest_vertex[colnames(cds), ])
  6.   root_pr_nodes <-
  7.   igraph::V(principal_graph(cds)[["UMAP"]])$name[as.numeric(names
  8.   (which.max(table(closest_vertex[cell_ids,]))))]
  9.   root_pr_nodes
  10. }

定义根节点

  1. #order cell
  2. cds <- order_cells(cds, root_pr_nodes=get_earliest_principal_node(cds))
  3. #pseudotime analysis
  4. plot_cells(cds,color_cells_by = "pseudotime",label_cell_groups=FALSE,label_leaves=FALSE,label_branch_points=FALSE,graph_label_size=1.5)

使用Monocle3对多样本单细胞数据进行伪时间分析 - 图5

在基因层面探索伪时间

寻找随时间变异的基因

  1. diff_gene <- graph_test(cds, neighbor_graph="principal_graph", cores=4)
  2. id <- row.names(subset(diff_gene, q_value < 0.05))
  3. head(id)
  4. [1] "CD74"    "CXCL14"  "HLA-DRA" "GAST"    "C1QB"    "HBA1"

在cds对象中寻找基因并作图，为了看出变化，可以选择case组中的表达量

  1. CASE_genes <- c("CD74", "CXCL14", "HLA-DRA")
  2. CASE_lineage_cds <- cds[rowData(cds)$gene_short_name %in% AFD_genes,colData(cds)$stim %in% c("CASE")]
  3. #plot genes
  4. plot_genes_in_pseudotime(AFD_lineage_cds,color_cells_by="Cell.type")

使用Monocle3对多样本单细胞数据进行伪时间分析 - 图6

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