前言

CRISPR 基因编辑技术近年来大热，因具有精确的编辑和较高的效率，成为动植物基因改造的热门技术，传统技术的分析过程采用 sanger 测序方法，通过对测序峰图的分析对其插入和删除效率进行分析，而随着二代测序技术逐渐成熟，结合 CRISPR 和 NGS 测序的数据分析必将大热，本文将总结一些 NGS 数据分析的软件予以参考

软件

1.CRISPResso2

CRISPresso2 软件是老牌的 crispr 数据分析软件，其功能多样，但是分析速度有待提高。

1.1 原理

Crispr-NGS data indel analysis - 图1

该软件通过对原始序列进行拼接（FLASH）,然后运用前文所讲的全局比对的方式进行序列 alan,对结果进行统计并作图

The CRISPResso suite accommodates single or pooled amplicon deep sequencing, WGS datasets and allows the direct comparison of individual experiments. In fact four additional utilities are provided:

  1. CRISPRessoPooled: a tool for the analysis of pooled amplicon experiments
  2. CRISPRessoWGS: a tool for the analysis of WGS data or prealigned reads in .bam format
  3. CRISPRessoCompare:a tool for the comparison of two CRISPResso analyses, useful for example to compare treated and untreated samples or to compare different experimental conditions
  4. CRISPRessoPooledCompare: a tool to compare experiments involving several regions analyzed by either CRISPRessoPooled or CRISPRessoWGS

简单说，包含很多功能模块，pool 是进行大批量数据和同一个参考基因组进行比对，同时返回每个数据组数据的程序；WGS 则是与全基因组进行比对的程序；Compare 则是带有 CK 对照组数据进行对比分析的程序，由此可见，该程序的复杂度很高，功能相对完善。

1.2 安装方法

建议通过conda的方式来安装.

打开终端并键入以下命令:

  1. conda config --add channels defaults
  2. conda config --add channels bioconda
  3. conda config --add channels conda-forge

为了避免安装对原有环境的影响，建议添加额外的环境

  1. conda create -n crispresso2_env -c bioconda crispresso2 python=2.7

安装完成后，可以通过执行以下命令验证安装是否完好:

CRISPResso -h

1.3 使用方法

因为二代测序多为双端测序，因此，这里只简单的介绍双端测序的使用方法

  1. CRISPResso -r1 reads1.fastq.gz -r2 reads2.fastq.gz -a ref.fa -g gRNA_no_PAM

2. CRISPR-DAV

CRISPR-DAV也是一个 pipline，不过是用 perl 语言书写的，本人对 perl 语言不甚了解，所以就不过多解释了，但是 git 上作者推荐使用 docker 安装，因此，感兴趣的可以尝试一波

2.1 安装方式

安装方式

3.Cas-analyzer

Cas-Analyzer 是一个快速的在线分析软件，其程序基于 JS 语言在网页上进行计算，其计算速度飞快，准确率也很高，但是可惜的是，没有原始数据下载，也没有本地版本

4.CRISPRMatch

CRISPRMatch同样是基于 Python 程序的 pipline,作者在文章中介绍说软件相比于传统的软件具有很大的优势，其中之一便是安装和使用简单，但实际体验一般

4.1 安装方法

4.1.1 安装 anaconda

  1. $ yum install wget git
  2. $ mkdir /home/software
  3. $ cd /home/software
  4. $ wget https://repo.continuum.io/archive/Anaconda3-5.0.1-Linux-x86_64.sh
  5. $ bash Anaconda3-5.0.1-Linux-x86_64.sh

4.1.2 安装依赖

  1. $ conda install bwa \
  2.                 samtools \
  3.                 picard \
  4.                 flash \
  5.                 matplotlib \
  6.                 pysam \
  7.                 pandas \
  8.                 argparse \
  9.                 numpy \

4.1.3 下载软件并测试

  1. $ cd /home/software
  2. $ git clone https://github.com/zhangtaolab/CRISPRMatch.git
  3. $ python3 /home/software/CRISPRMatch/CRISPRMatch.py -h
  5.   usage: CRISPRMatch [-h] [--version] [-b BWA] [-sm SAMTOOLS] [-pi PICARD] -g
  6.                     GENOME -i INPUT -gi GROUPINFO [-s SAVED] [-r RESULT]
  7.                     [-t THREADS] [--docker DOCKER]
  9.   CRISPRMatch is for location finding
  11.   optional arguments:
  12.     -h, --help            show this help message and exit
  13.     --version             show program's version number and exit
  14.     -b BWA, --bwa BWA     bwa path
  15.     -sm SAMTOOLS, --samtools SAMTOOLS
  16.                           samtools path
  17.     -pi PICARD, --picard PICARD
  18.                           picard path
  19.     -g GENOME, --genome GENOME
  20.                           fasta format genome file
  21.     -i INPUT, --input INPUT
  22.                           sample information input file
  23.     -gi GROUPINFO, --groupinfo GROUPINFO
  24.                           group information input file
  25.     -s SAVED, --save SAVED
  26.                           tmp saved folder
  27.     -r RESULT, --result RESULT
  28.                           result saved folder
  29.     -t THREADS, --threads THREADS
  30.                           threads number or how may cpu you wanna use

4.2 使用方法

软件使用需要提前转备好 3 个文件，分别是

  • 参考基因序列
  • 样本信息
  • 分组信息

具体的格式应该严格参照作者提供的示例数据格式（sampledata,sampledata2）

3.4 运行

  1. $ cd /home/software/CRISPRMatch/
  2. $ python3 CRISPRMatch_paired.py -g sampledata2/Samples_gene.fa -i sampledata2/sample_infor.txt -gi sampledata2/group_info.txt -t 2