chipseq-0-课程序言

  • 00:01:10 - chipseq该怎么学？
  • 00:03:12 - 文献《Polycomb Associates Genome-wide with a Specific RNA Polymerase Il Variant, and Regulates Metabolic Genes in ESCs》
  • 00:03:20 - PRC1和PRC2分别是什么

chipseq-1-表观遗传性背景知识

  • 00:00:40 - ATAC-seq
  • 00:01:30 - 表观遗传学的背景 2016nature methods年度技术：表观转录组分析（Epitranscriptome analysis）

和转录组联系在一起
NGS与转录

  • 00:04:48 - 一篇文章学会ChIP-seq分析

    chipseq-2-技术的背景介绍

  • 00:00:38 - ChIP-Seq研究蛋白质被修饰

  • 00:02:38 - 什么是ChIP-Seq

  • 00:04:50 - ChIP-Seq的应用：

    chipseq-3-阅读综述

  • 00:00:00 -

  • 00:04:20 - 阅读超过5个公司的ChIP-Seq数据分析结题报告
  • 00:04:36 - 示例文章，如何通过文章找到ChIP-Seq的数据分析流程

Fish the ChIPs: a pipeline for automated genomic annotation of ChIP-Seq data
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21978789/

  • 00:05:41 - Using MACS to Identify Peaks from ChIP-Seq Data
  • 00:05:56 - Practical Guidelines for the Comprehensive Analysis of ChIP-seq Data

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24244136/

chipseq-4-数据分析流程的提炼

  • 00:00:27 - 主干和侧枝
  • 00:01:10 - 三个步骤

测序数据变fastq
motif和peaks annotation
IGV非主要流程，验证

  • 00:01:56 - 2013-Practical Guidelines for the Comprehensive Analysis of ChIP-seq Data

实验设计——质量过滤——比对——校正——peaks calling——显著性检验——

  • 00:05:28 - 参考ppt：ChIP-seq analysis

chipseq.pdfchipseq2.pdf

  • 00:00:00 -
  • 00:07:27 - bam变为其他格式，bw、bg格式用于IGV中查看
  • 00:09:16 - U2B 视频：

An introduction to ChIP-seq analysis https://www.youtube.com/watch?v=zwuUveGgmS0
ChIP-Seq Alignment, Peak Calling, and Visualization https://www.youtube.com/watch?v=XVIP_M5qEGw

  • 00:11:50 - 背景洗脱非常麻烦，存在假阳性假阴性，需要结合背景对照
  • 00:12:38 - ChIP-seq实验注意细节，选择什么作为control（IgG or input）

不推荐gG，原因是：第一，大多数的lgG抗体不是来源于转录因子或特定组蛋白抗体同一动物的免疫前血清。第二，lgG通常 pull down非常少的DNA，这样导致在后期的建库过程中 PCR Cycles数增加，导致不能达到作为 control去除背景噪音的目的（会缺失和放大部分信息）。
因此比较而言， Input更适合作为 control。首先 Input的建库量够，这样建库过程不需要 over-amplifed,bias小。其次，最后测序得到的数据更均匀，以及全基因组覆盖度会更好。有人提到 deletion或者 RNAi knockdown目标转录因子的细胞同时做chP-Seq作为 contro更好。

  • 00:13:21 - 组蛋白修饰和转录因子结合的ChIP-Seq数据区别 需要了解
  • 00:13:38 - 实例
  • 00:15:03 - 阅读文献 Zebl potentiates genome-wide gene transcription with Lef1 to promote glioblastoma cell invasion

https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.201797115

  • 00:15:38 - 实战：根据流程找软件

sra-tools
fastqc、multiqc、trim_galore
bowtie、bowtie2、bwa
MACS2、homer
deeptools
meme motif
annotation(R包，ChIPpeakAnno、ChIPseeker)
高阶分析
peaks差异分析
peaks对应的基因的富集分析

chipseq-5-软件安装

  • 00:00:17 - 找到常规流程，搞清楚每个步骤在做什么事情
  • 00:00:34 - 相关技能的学习——安装工具
  • 00:00:48 - 测试数据来源：Polycomb Associates Genome-wide with a Specific RNA Polymerase ll Variant, and Regulates Metabolic Genes in ESCs

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22305566/

  • 00:01:25 - 看文章首先找到GSE号，搜索下载数据集
  • 00:03:00 - RNA-seq步骤用了Tophat
  • 00:03:20 - UCSC annotation, Tophat, Cufflinks计算FPKM levels
  • 00:03:40 - TES和TSS（分别是什么？）

转录起始位点（Transcription Start Site, TSS）：是指一个基因的5’端转录的第一个碱基，它是与新生RNA链第一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为一个嘌呤（A或G）。
通常把转录起始位点前即5’末端的序列称为上游，而把其后即3‘末端的序列称为下游。
知识点：转录起始位点是指一个基因的5’端转录的第一个碱基。
相应的：转录终点（transcription end sites，TES）
TSS/TES 可视化 通过deeptools实现

  • 00:03:56 - 找到的基因应用topGO进行富集，并利用org.Mm.eg.db（包含着每个基因对应的信息）包寻找通路
  • 00:04:12 - 利用KEGG pathways进行下一步分析
  • 00:05:46 - 《给学徒的WES数据分析流程》
  • 00:06:07 - 给TextWrangler上色：#!/bin/bash
  • 00:06:19 - 第一步，更改源为清华镜像源
  • 00:06:30 - 创建名为chipseq的环境变量
  • 00:07:02 - conda下安装软件
  • 00:08:41 - 整个tmp可以所有人一起访问
  • 00:12:12 - 安装trim-galore（不是trim_galore）
  • 00:13:30 - 安装macs2、bowtie、bowtie2
  • 00:14:21 - 进入R中安装R包
  • 00:15:15 - 安装时的重要技巧

homer相关：《找个motif嘛,简单》

  • 00:15:37 - 有些软件需要数据库支持，而有些软件数据库默认在软件目录下，homer需要先下载database才能使用
  • 00:17:00 - 通过 which homer 找到homer这个软件的位置，
  • 00:17:26 - homer的data位置在：*/share/homer-4.9.1-5/data/ 当中